高效液相色谱法测定灰兜巴对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

孙彦敏，彭 亮，李知敏

江西科技师范大学药学院，南昌 330013

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，已成为严重威胁人类健康的慢性病之一。不管在发达国家还是在发展中国家，由于人们的生活和饮食习惯，糖尿病已成为一种常见病。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为一种新型糖尿病治疗药物，其重要性已经得到越来越多的关注。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过阻止α-葡萄糖苷酶在小肠内的消化而减少低聚糖和二糖消化为单糖的量，从而降低血糖吸收速率［1］。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过调节α-葡萄糖苷酶活性可治疗病毒感染、肿瘤、肥胖症、溶酶体贮积症［2］、高三酰甘油血脂症［3］等多种疾病，其临床应用广泛。目前，临床上的α-葡萄糖苷酶抑制剂大多是生物合成药或者半合成药，其价格昂贵且副作用大，临床研究表明部分患者在使用α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药物后，会出现肠胃腹泻、痉挛等不同程度的不良反应［4］，部分西药的毒副反应可能会加重其他器官组织的负担，如心血管系统、肾脏系统等，导致糖尿病并发症的严重，因此，从天然药物中寻求安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂的目标越来越迫切［5］。

灰兜巴又名闭口袋，近千年来，在峨眉山地区被当地居民用来防治糖尿病［6］。其有“仙山灵药”、“糖尿病克星”和“天然纯绿色的大自然珍宝”的美誉［7］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)［8］作为底物，PNPG在α-葡萄糖苷酶的催化作用下可分解为PNP，以PNP 作为检测峰可衡量中药对于α-葡萄糖苷酶的抑制作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选现多选用紫外分光光度法作为检测手段，但是试剂消耗大，且重现性差，尤其对复杂样品或者有颜色干扰的样品，其假阳性高［9］。而PNP 在HPLC 上有一明显的峰［10］，故本研究采用HPLC 测定灰兜巴各提取部分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，根据PNP 峰面积的变化值来计算灰兜巴抑制α-葡萄糖苷酶活性，作为衡量标准，并在反应过程中比较振荡和不振荡对抑制率的影响。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

灰兜巴购自峨眉山灰兜巴批发零售中心

1.2 实验试剂

α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)及还原型谷胱甘肽均购自美国Sigma 公司产品;对硝基苯酚(PNP)购自上海源叶生物科技有限公司;pH 6.8 磷酸钾(PBS)缓冲液、无水碳酸钠(Na2CO3)、二甲亚砜(DMSO)、甲酸、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均为国产分析纯，甲醇，乙腈为色谱纯。

1.3 实验设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪，安捷伦有限公司;美国Vortex-Genie2 涡旋振荡器，美国Scientific Industries 公司;FA2004N 电子天平，上海精密科学仪器有限公司;XS203S 电子精密天平，瑞士梅特勒-托利多;LR 4000 旋转蒸发仪，德国海道夫。

2 实验方法

2.1 灰兜巴提取物的制备

称取一定量的灰兜巴置于圆底烧瓶中，以1∶10(M/V)料液比向其中加入75%的乙醇，85 ℃回流提取1.5 h，反复3 次，合并滤液，收集滤渣待用。将所得的乙醇提取液浓缩至无醇味，用1∶1(V/V)石油醚萃取8 次，合并萃取液后，减压浓缩至干，得到灰兜巴石油醚萃取部分，记为HDB-1。将石油醚萃取后的剩余溶液，用1∶1(V/V)乙酸乙酯萃取8 次，合并萃取液，减压浓缩至干，得到灰兜巴乙酸乙酯萃取部分，记为HDB-2。将乙酸乙酯萃取后的剩余溶液，用1∶1(V/V)正丁醇萃取8 次，合并萃取液，减压浓缩至干，得到灰兜巴正丁醇萃取部分，记为HDB-3。将正丁醇萃取剩余后的溶液减压浓缩至干，得到灰兜巴萃取剩余部分，记为HDB-4。将醇提后的灰兜巴滤渣用蒸馏水在95 ℃下提取1.5 h，重复3 次，合并滤液并减压浓缩至干，得灰兜巴水提取液，记为HDB-5。

2.2 HPLC 分析条件

色谱条件:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱;Agilent C18(4.6 mm ×12.5 mm，5 μm)保护柱;流动相:A 为乙腈，B 为含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱条件为0～8 min，20%～30%A;8～13 min，30%～80% A;13～18 min，80%～20%A;18～28 min，20%A;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;柱温:25 ℃;检测波长:314 nm。

2.3 PNP 标准曲线的制备

精密称取0.0209 g PNP 标准品，用磷酸盐缓冲溶液超声溶解，定容于25 mL 容量瓶中，配制成0.84 mg/mL 的PNP 母液，将母液分别稀释成0.0025、0.005、0.01、0.05、0.1 mmol/L 浓度。

将上述不同浓度的PNP 标准品按照2.2 中色谱条件测定，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4 HPLC 方法学考察

精密度试验:精密吸取0.01 mmol/L PNP 溶液，连续进样6 次，记录PNP 峰面积的RSD 值;稳定性试验:精密吸取PNP 溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6 h不同时间进样20 μL，记录峰面积，计算RSD 值，检测PNP 的稳定性;重现性试验:在相同条件下重复做样6 次，按2.2 项中色谱条件检测，记录峰面积，计算RSD 值;回收率试验:不加反应药液，将α-葡萄糖苷酶替换为PNP 标准溶液做阴性对照，按60%、80%、100%、120%、140%水平分别添加对照品，进行测定，计算回收率。

2.5 灰兜巴不同提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性实验流程

取2个试管，分别加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸钾缓冲液1.0 mL，3 mmol/L 谷胱甘肽溶液0.2 mL，0.04 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液0.3 mL，及0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL 灰兜巴醇提石油醚萃取物、醇提乙酸乙酯萃取物、醇提正丁醇萃取物、萃取剩余物、水提物均0.3 mL，混匀，37 ℃水浴保温10 min 后，加入0.2 mg/mL 的PNPG 溶液0.5 mL，反应10 min 后，再加入0.1 mol/L 碳酸钠溶液8 mL终止反应，其反应液过0.45 μm 微孔滤膜后，用HPLC 按2.2 项所述色谱条件进行检测，PNP 峰面积记为A1。

另取试管，用等体积溶解样品的试剂作空白，实验步骤同上，PNP 峰面积记为A2。按以下公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率:

2.6 振荡对药物抑制率影响的研究

分别取0.08 mg/mL 的HDB-1，0.05 mg/mL 的HDB-2，0.3 mg/mL 的HDB-3，2 mg/mL 的HDB-4 和2 mg/mL 的HDB-5 为样品检测，按2.5 中反应条件，在水浴反应过程中分别对其每2 min 振荡5s;不振荡，每组实验重复5 次。最终用碳酸钠终止反应，将反应完毕的溶液0.45 μm 微孔滤膜过滤，以2.2中的色谱条件用高效液相进行定量分析，计算其抑制率并比较振荡和不振荡对灰兜巴抑制α-葡萄糖苷酶活性作用影响的差异。

3 实验结果

3.1 PNP 标准工作曲线

按照2.3 的方法绘制标准曲线，求得回归方程为Y=6599.6X +1.2734，R2=0.9998，说明PNP 在0.0025～0.1 mmol/L 浓度范围内线性关系良好。

3.2 HPLC 方法学考察

精密度试验:PNP 峰面积的RSD 值为0.295%，表明仪器精密度良好;稳定性试验:分别在0、1、2、3、4、5、6 h 不同时间检测PNP 的稳定性，其RSD 值为0.65%，证明PNP 在此条件下稳定性良好;重复性试验:PNP 峰面积的RSD 值为0.79%，表明此反应条件操作可重复性较好，有良好的重现性;回收率试验:实验测的的回收率分别为98.08%、101.13%、100.97%、99.24%、101.29%，由此证明标准曲线准确性良好。

3.3 振荡对酶抑制率的影响

分别取0.08 mg/mL 的HDB-1，0.05 mg/mL 的HDB-2，0.3 mg/mL 的HDB-3，2 mg/mL 的HDB-4 和2 mg/mL 的HDB-5，按2.5 中反应条件，在水浴反应过程中分别对反应溶液每2 min 振荡5 s;不振荡。反应结束后，按照2.2 的色谱条件进行检测，并计算酶抑制率。实验结果见表1，HPLC 谱图见图1。

表1 振荡对灰兜巴提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响(x± s，n=5)Table 1 Effect of shaking on the α-glucosidase inhibition rate (x± s，n=5)

图1 灰兜巴各提取部分振荡与不振荡的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reaction with and without shaking

由表1 和图1 的结果可以看出，振荡对反应结果的影响很大，5 种灰兜巴提取部分在振荡后，抑制率均明显较不振荡要高。因此，在后续的酶抑制试验中，反应溶液采用每2 min 振荡5 s，以保证反应结果的准确性和重复性。

3.4 灰兜巴各提取部分抑制α-葡萄糖苷酶的活性

按照2.2 的反应条件和色谱条件进行试验，并计算酶抑制率，试验结果见图2，同时根据2.5 的反应条件，但不加α-葡萄糖苷酶，以考察灰兜巴各提取部分中是否存在与PNP 结构相似的成分，以及在酶反应条件下，灰兜巴各提取部分是否会使PNPG分解产生PNP，试验结果的HPLC 谱图见图3。

图2 灰兜巴各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibitory activity of different HDB extracts on α-glucosidase

图3 不加α-葡萄糖苷酶的反应结果Fig.3 The reaction result without α-glucosidase

由图3 可看出，不加α-葡萄糖苷酶的反应液在13.9 min 附近没有峰出现，证明灰兜巴各提取部分在PNP 峰处无干扰峰出现，不会对试验结果产生干扰。图2 表明灰兜巴具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且灰兜巴石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部分的抑制活性较高，而醇提剩余部分和水提部分的抑制活性较低。

4 结果与讨论

本研究首次通过高效液相色谱法研究灰兜巴石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、醇提萃取剩余物以及水提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性并比较在反应过程中振荡对抑制率的影响。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)在α-葡萄糖苷酶的催化作用下，可生成对硝基酚(PNP)和葡萄糖，在本次研究中，我们取PNP 作为检测峰［10］，通过高效液相色谱法检测PNP 峰面积的变化从而反映供试品对α-葡萄糖苷酶抑制能力的强弱。结果发现，灰兜巴石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分均有良好的抑制活性，而灰兜巴醇提剩余部分和水提部分的抑制活性较弱。同时通过比较在反应过程中对反应液进行振荡与不振荡，发现振荡以后其抑制率会增加，而且试验结果的重现性更好。这可能是因为每隔一段时间振荡后，药物与酶在溶液中的分布更加均匀，从而使酶与药物的反应过程更加稳定。因此，在后续的研究过程中应严格控制振荡频率及时间，以保证试验结果的重复性良好。

通过研究表明灰兜巴可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性从而发挥其降糖作用，为一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。项目组前期利用紫外-可见分光光度法对灰兜巴各提取部分的α-葡萄糖苷酶抑制作用进行了初步研究［11］，在试验过程中发现，由于各提取部分本身在检测波长下均有吸收，会对试验结果产生较大干扰，导致试验结果重现性较差。因此，本次实验选用HPLC 法测定PNP 的峰面积，再计算酶抑制率。高效液相色谱法较于传统的紫外分光光度法检测α-葡萄糖苷酶的抑制活性，误差小，重现性高，可有效将所需峰与其他干扰峰分离开，通过调整保留时间可消除药物本身对于PNP 检测峰的影响，使结果更加准确可靠，是一种更为简单、有效且新颖的研究α-葡萄糖苷酶抑制的方法。

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