毛脉酸模内生真菌蒽醌类次生代谢产物的筛选及含量分析

郭 美，王谦博，王宗伟，贾力维，王振月*

1黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040;2 黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨 150010

毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz.)为蓼科酸模属多年生宿根草本植物，多生于山区沟谷低湿草甸及杂草丛中，广泛分布于黑龙江、吉林长白山等地区。毛脉酸模味甘性寒。有清热解毒、凉血止血、通便利尿之功效，具有抗真菌、抗肿瘤、镇咳祛痰、平喘降压、抗病毒和抗氧化等药理作用。毛脉酸模中含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类以及酸模素类等化学成分［1，2］。其中蒽醌类化学成分具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、保肝、利胆、免疫抑制、泻下等药理作用［3-5］。

植物内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织内部，不会对宿主造成明显伤害，并与宿主植物建立和谐关系的一类真菌。内生真菌与宿主植物长期相互作用，建立了平衡关系，很可能遗传物质相互传递。研究表明，内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力［6，7］。王玉美［8］等人从喜树内生真菌中筛选出产喜树碱的菌株，喜树碱产量为774 μg/L;艾海新［9］等从南方红豆杉树皮中分离得到的内生真菌中筛选出一株产紫杉醇的菌株，其产量为53.68 μg/L。药用植物内生真菌具有多样性，可以产生有应用价值的代谢物质，利用内生真菌大规模发酵从而实现工业化生产，可以降低产品成本，满足需求，同时有利于药用植物资源的保护。内生真菌发酵培养作为寻找活性成分的手段之一，日益受到人们的重视。本课题组前期已从不同产地分离得到毛脉酸模内生真菌278 株，本实验以不同产地毛脉酸模内生真菌为研究对象，通过HPLC 对其次生代谢产物进行研究，以大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素五种蒽醌类成分为参照，寻找有益菌株，并对成分较高的菌株进行含量测定，确定其产量，以确立进一步开发利用的价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

样品为毛脉酸模中分离得到的278 株内生真菌，由本课题组前期从黑龙江省图强(TQ)、塔河(TH)、新林(XL)、加格达奇(JQ)、绥棱(SL)、乌伊岭(WY)、红星(HX)、上甘岭(SG)、桃山(TS)及黑龙江中医药大学药用植物园(YY)十个产地分离得到。大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品购买于中国药品生物制品检定所。

1.1.2 仪器与试剂

美国Waters 高效液相色谱仪(Waters 600 型泵，2487 型二极管阵列检测器，Empower 色谱工作站);BSD-100 振荡培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);二级B2 型生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。

甲醇:色谱纯(美国DIKMA 试剂公司);磷酸:分析纯(天津市天河化学试剂厂);水:饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养

将活化后的菌株接种于锥形瓶中，28 ℃、160 rpm 下震荡培养7 d。在60 ℃水浴下，将菌体与发酵液共同蒸干得内生真菌发酵产物。另取适量马铃薯葡萄糖液体培养基，60 ℃下水浴蒸干，作为空白对照。

1.2.2 供试品溶液的制备

取4 g 蒸干后的内生真菌发酵产物，置于圆底烧瓶中，加入甲醇20 mL，称重。加热回流，补足损失后滤过。得到内生真菌次生代谢产物的提取物。滤液过0.45 μm 滤膜，作为供试品溶液备用。同时将空白培养基及毛脉酸模植物根、茎、叶粉末做同样处理。

1.2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品2.75、4.15、3.10、3.70、2.50 mg，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶内，配制成浓度依次为110、166、124、148、100 μg/mL 的对照品溶液;参照毛脉酸模根中各成分含量，分别依次精密称取各对照品2.45、0.50、6.95、3.03、2.97 mg，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶内，配成含大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素分别为98、20、278、121、119 μg/mL 的混合对照品溶液。

1.2.4 色谱条件的选择

色谱柱Gemini C18分析柱(250 mm ×4.60 mm，5 μm)。流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。流动相为甲醇-0.1%磷酸水，梯度洗脱:0 min，30%甲醇;0～50 min，30%～100%甲醇;50～60 min，100%甲醇。此条件的混合对照品图见图1。

图1 混合对照品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference

1.2.5 蒽醌类次生代谢产物的筛选及含量分析

按上述色谱条件进样，记录样品色谱图中各色谱峰的保留时间与峰面积，排除空白干扰，与对照品进行比对，进行初步筛选，得到含蒽醌类成分的内生真菌。为保证实验结果的准确性，将含蒽醌类成分内生真菌的供试品溶液与相应成分的对照品溶液进行重复进样比对，减小误差。并进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

分别取五种对照品溶液，按照上述色谱条件进样，依次进2、5、10、15、20 μL 以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程得大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的线性回归方程，线性范围分别在0.220～2.200、0.332～3.320、0.248～2.480、0.296～2.960、0.200～2.000 μg 内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。回归方程分别为:Y=1E+06X-128668，R2=0.9996;Y=3E+06X-111432，R2=0.9997;Y=2E+06X-269995，R2=0.9991;Y=1E +06X-232364，R2=0.9998;Y=2E +06X-146665，R2=0.9997。

2.2 精密度试验

取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6 次，测定峰面积，计算RSD 值，结果大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的RSD 值分别为0.6%、0.9%、1.0%、0.8%、1.1%。

2.3 稳定性试验

取混合对照品溶液，按上述色谱条件，分别在0、2、4、8、12 和24 h 进样，分别测定大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的峰面积，计算RSD 值分别为1.2%、1.2%、1.3%、1.3%、1.1%。

2.4 重复性试验

取毛脉酸模根部粉末6 份，按供试品溶液制备方法制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素含量平均值的RSD 值分别为1.9%、2.0%、1.7%、1.3%、2.1%。

2.5 加样回收率试验

取已知含量的毛脉酸模根部粉末6 份，精密加入混合对照品溶液5 mL，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进行测定，计算平均回收率，结果大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的平均回收率(n=6)分别为98.9%、100.4%、99.5%、103.7%、99.1%，RSD 值分别为1.14%、1.72%、0.89%、1.22%、0.97%。

2.6 蒽醌类次生代谢产物的筛选结果

按“1.2.2”的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。以大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素五种蒽醌类成分为参照，共筛选出11 株内生真菌含蒽醌类成分，其中含大黄素的有TH-R2、SL-R3、XL-S9;含大黄酸的有YY-S1、YY-S8、YY-S13;含芦荟大黄素的有TQ-S4、TQ-S5、TQ-S16、JQ-S4、XL-S13。色谱图见图2。图2 中各色谱图由下到上依次为TH-R2、SL-R3、XL-S9、大黄素、YYS1、YY-S8、YY-S13、大黄酸、TQ-S4、TQ-S5、TQ-S16、JQ-S4、XL-S13、芦荟大黄素、空白对照。从图2 可以看出，同一产地的菌株成分较为相似，部分菌株除含有测定成分外还含有其他成分。

图2 空白、对照品及样品的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of blank，standards and samples

2.7 菌株概况及含量测定结果

样品及毛脉酸模植物根、茎按“1.2.2”的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，其中原植物茎中未能直接检测出相应的成分。将根、茎中离得到的内生真菌的含量与原植物根、茎中相应成分进行比对，其中菌除TH-R2 外，各菌株所含成分均比其分离部位的相应化学成分含量高，具体数据见表1。

表1 菌株的概况及样品测定结果Table 1 The overview of endophytic fungi and the determination results of anthraquinones contents in samples

注:分离频率是指样本中分离到的某种内生真菌的菌株数占分离到总菌株数的百分数。R-从根中分离得到，S-从茎中分离得到。Note:Separation frequency refers to the percentage of strains of endophytic fungus isolated from each sample to the total number of strains.R-obtained from roots，S-obtained from stems.

3 讨论

为了最大限度的提取发酵产物中的有效成分，本实验以毛脉酸模原植物为参照，分别考察了甲醇回流、50%乙醇回流、甲醇超声等提取方法，在同一色谱条件下测定，结果表明，甲醇回流及50%乙醇回流效果较好，考虑到方法操作简便省时，本实验采用甲醇回流后直接进行测定。并采取适合于毛脉酸模化学成分分析的色谱条件进行测定，在五种蒽醌类对照品的基础上，同时可对其它类有效成分进行考察，通过观察液相色谱图，寻找含其它类成分的菌株，在完成目标任务的同时可发现更多的有益菌株，以确立进一步开发利用的价值。

本研究确定有11 株内生真菌含有蒽醌类成分，相对宿主植物而言各菌株均有较高的含量，其中含大黄素的菌SL-R3 含量高达683 μg/g，为毛脉酸模蒽醌类成分中含量最高的内生真菌。从研究结果我们发现含蒽醌类成分的菌种青霉属(Penicillium)、链格饱属(Alternaria)、色串饱属(Tolura)、镰饱属(Fusarium)等为分离频率较高的菌种，同样是毛脉酸模的优势菌种。结合各内生真菌的分离产地、分离部位，因此我们可进一步推断，产生与宿主相同或相似化学成分的内生真菌可能与其自身的种属、分离的环境及分离部位有关，接下来我们将进一步研究含量较高的内生真菌的稳定性，以及大规模发酵的可行性，我们将通过优化发酵条件，对菌株进行诱变育种等方式来进一步提高产量，以达到工业化生产的要求。本研究除发现含蒽醌类成分外，部分菌株还含有其它化学成分，这也说明内生真菌次生代谢产物丰富多样，为我们对内生真菌的进一步研究奠定基础。

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