耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的体外联合药敏试验研究

刘 盼，王志达（1.赤峰学院附属医院，内蒙古赤峰 04005；.赤峰学院第二附属医院，内蒙古赤峰 04000）

鲍曼不动杆菌主要引起医院内感染，我国2010 年以来的统计结果显示鲍曼不动杆菌的临床分离率已位居第一位［1］。在医院内，鲍曼不动杆菌主要来源于重症监护病房、神经内科及呼吸内科，而且上述科室分离的鲍曼不动杆菌因优势克隆株的播散［2］，细菌耐药性较高，常引起医院获得性肺炎的暴发流行。碳青霉烯类抗生素是治疗鲍曼不动杆菌最有效的药物，但近年来世界各地报道了多起耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起的医院内感染［3-4］，给临床治疗带来了极大困难。因此，寻找对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌敏感的抗菌药物组合，对防治鲍曼不动杆菌引起的医院获得性肺炎具有重要意义。本研究通过体外联合药敏试验，旨在寻找有效对抗耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的抗菌药物组合，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选取2010 年3 月至2014 年1 月期间，赤峰学院附属医院（简称“我院”）呼吸内科不同患者的非重复痰标本中分离出的420株鲍曼不动杆菌，选取其中72株耐碳青霉烯菌株作为研究对象。 选取大肠埃希菌（ATCC25922）、大肠埃希菌（ATCC35218）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）作为质控菌株。抗菌药物组合有：头孢哌酮/舒巴坦（CFS）+利福平（RFP）、CFS+米诺环素（MIN）、CFS+美罗培南（MER）、CFS+左氧氟沙星（LEV）、MIN+MER。

1.2 试验方法

采用棋盘法设计微量肉汤稀释法进行联合药敏试验，比较各抗菌药物组合单用与联合应用的最低抑菌浓度（MIC）及各抗菌药物组合的联合抑菌指数（FIC），评价各抗菌药物组合对鲍曼不动杆菌的抗菌效果。

1.2.1 菌悬液的制备。挑取3～5 个新鲜培养、分离提纯并过夜的菌落，接种于MH 肉汤中，增菌培养6 h，菌液用3 ml HM肉汤通过比浊仪校正至0.5麦氏比浊管，再用MH 肉汤稀释至1.5×105CFU/ml。

1.2.2 抗菌药物储备液的制备。RFP以甲醇溶解、稀释制成浓度为640 μg/ml的储备液；其余抗菌药物用灭菌注射用水溶解、稀释制成浓度为1 920 μg/ml的储备液。

1.2.3 接种。将CFS、RFP、MIN、MER、LEV 储备液用灭菌MH肉汤稀释成以下12个浓度梯度：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/ml，将配制好的不同浓度的各抗菌药物按“1.1”项下方案组合，按棋盘法设计加入96 孔平板中，每种抗菌药物加50 μl，使两种药物的稀释液分别在棋盘方阵的横列和纵列，再于每个孔中加入100 μl的1.5×105CFU/ml的菌液，37 ℃培养过夜。

1.2.4 结果判断。阳性对照孔有菌生长而空白对照孔无细菌生长；96孔平板通过衬有黑色底板的光线观察，板孔浑浊或孔底有网状或丝状沉淀，则为有细菌生长，读取MIC。记录单独应用上述组合的抗菌药的MIC（MIC甲药单用和MIC乙药单用）及组合时各抗菌药的MIC（MIC甲药联用和MIC乙药联用），计算FIC。FIC＝MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。FIC≤0.5，则认为两药联用有协同作用；0.5＜FIC＜1，则认为两药联用有相加作用；1＜FIC≤2，则认为两药联用为无关作用；FIC≥2，则认为两药联用有拮抗作用。

1.2.5 质量控制。待测抗菌药物对大肠埃希菌（ATCC25922）、大肠埃希菌（ATCC35218）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）的MIC符合2010年临床实验室标准化协会（CLSI）的质控标准。

2 结果

2.1 各组抗菌药单用与联用对鲍曼不动杆菌的MIC比较

（1）CFS+RFP：CFS 的MIC50和MIC90较单用时明显下降，RFP的MIC50和MIC90均下降为单药MIC的1/4。（2）CFS+MIN：CFS的MIC50与MIC90分别为单用时的1/2和1/4，MIN的MIC50为单用时的1/4。（3）CFS+LEV：CFS的MIC50与MIC90分别为单用时的1/2 和1/4，LEV 的MIC50为单用时的1/2。（4）CFS+MER：CFS 的MIC50与MIC90均为单用时的1/4，MER 的MIC50与MIC90为单用时的1/4 和1/2。（5）MER+MIN：MER 的MIC50与MIC90均为单用时的1/2，MIN 的MIC50与MIC90为单用时的1/4和1/2。各药物及组合的MIC结果详见表1。

表1 各组抗菌药物单用与联用对鲍曼不动杆菌的MIC（μg/ml，n＝72）Tab 1 MIC of drugs used alone or in combination against Acinetobacter baumannii of each group（μg/ml，n＝72）

2.2 各抗菌药物组合的FIC

CFS 与RFP、MIN、MER 的联合应用，MIN 与MER 的联合应用对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的抗菌效应主要表现为协同和相加作用；CFS与LEV联合应用主要表现为无关作用，小部分表现为协同和相加作用，具体结果见表2。

表2 各抗菌药物组合的FIC构成比（%）Tab 2 FIC proportion of each antimicrobial drug combination（%）

3 讨论

3.1 试验抗菌药物组合遴选依据

CFS对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染有一定疗效［5］，有研究显示鲍曼不动杆菌感染用CFS 治疗效果良好［6-7］；MIN 是一种广谱的四环素类抗生素，可与核糖体3S亚基特异性地结合，阻止转运RNA（tRNA）的合成，终止肽链的延长，可有效对抗鲍曼不动杆菌的感染［8］。也有报道显示，RFP联合其他抗菌药可以治疗鲍曼不动杆菌感染［9］。因此，本研究采用这几种抗菌药物进行组合试验。

3.2 鲍曼不动杆菌的耐药趋势及诱发因素

鲍曼不动杆菌是临床常见条件致病菌，碳青霉烯类抗菌药曾对该菌具有较好的抗菌作用，然而近几年随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，鲍曼不动杆菌对其耐药率逐渐上升。据CHINET 中国细菌耐药监测网检测结果显示，2009 年鲍曼不动杆菌对MER 和亚胺培南的耐药率分别为52.4%和50.0%，2010 年分别上升至58.3%和57.1%［1］。而我院检验科细菌室对鲍曼不动杆菌耐药监测结果也提示鲍曼不动杆菌不仅对亚胺培南、MER 耐药，而且对广谱青霉素如哌拉西林/他唑巴坦和单环β-内酰胺类氨曲南的耐药率也已接近100%，对头孢他啶、头孢哌酮的耐药率也达80%以上，对氨基糖苷类庆大霉素、阿米卡星的耐药率大于90%，甚至对多粘菌素B的耐药率也达30%以上，可见鲍曼不动杆菌对抗菌药物呈现出高耐药性。导致鲍曼不动杆菌耐药的因素很多，主要有患者住院时间长、抗菌药物的长期应用、患者自身患有多种基础疾病、医院内侵袭性操作、患者免疫力及营养状态差等。由于对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起的感染尚缺乏有效的抗菌药物［9］，临床已报道了多起耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起的院内感染的暴发流行。

3.3 鲍曼不动杆菌耐药机制及抗菌药物单用及联合应用的抑菌活性

鲍曼不动杆菌耐药机制主要是产生碳青霉烯酶、青霉素结合蛋白改变、外排泵的表达、膜孔道蛋白的缺失等。CFS治疗耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌感染效果良好，因为舒巴坦可与鲍曼不动杆菌的青霉素结合蛋白不可逆地结合，同时抑制碳青霉烯水解酶的活性。但有研究表明，2009 年鲍曼不动杆菌对CFS的耐药率达23.6%，显著高于2008年的14.6%；且抗菌药物单一使用多因剂量大、浓度高，会产生肝肾毒性，长期单一用药又易诱发细菌耐药性产生。在此情况下，联合用药成为必要的选择，尤其是对重症感染。基于此，本研究以CFS为主药，分别联合RFP、MIN、MER 和LEV 进行联合体外药敏试验，同时对MIN 联合MER 进行联合药敏试验，计算各药单用及联合应用的FIC，来判断各抗菌药联合应用的抗菌效应，以寻找最佳的对抗耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染的抗菌药物组合。抑菌试验结果显示，CFS 与RFP、MER、MIN 联合应用后，各药的MIC50和MIC90均较单用时显著下降，FIC 主要表现为协同与相加作用，说明CFS 与上述药物联合应用对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌具有较好的体外抑菌活性。同样，MER 与MIN联合应用也对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌产生了良好的体外抑菌活性。而CFS 与LEV 联合应用则多数表现为无关作用，对部分耐碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌有协同作用。

综上所述，由耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起的医院内感染，临床可根据患者个体情况分别选择CFS 与RFP、MIN、MER联用或MIN与MER联用来进行治疗，可获得协同及相加的抗菌效果。

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