HPLC法测定养阴降糖胶囊中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

陈登丰，何孝金（1.福建中医药大学附属南平市人民医院，福建南平 353000；.南平市药品检验所，福建南平 353000）

养阴降糖胶囊系我院名老中医经验方，主要由玄参、地黄、苍术、黄芪等组成，具有益气养阴、清热降糖的作用，临床用于气阴不足、内热消渴，证见烦热口渴、多饮多食、倦怠乏力。2 型糖尿病即见上述证候。该药在福建中医药大学附属南平市医院（简称“我院”）临床使用多年，疗效确切。玄参在该制剂中为君药，哈巴苷、哈巴俄苷为玄参主要药效成分［1-2］。因此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）-梯度洗脱法同时测定该制剂中哈巴苷、哈巴俄苷的含量，以建立该制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

Agilent1100 高效液相色谱仪；梅特勒XS205DU 电子天平；Millipore超纯水器。

养阴降糖胶囊由本院制剂室提供；哈巴苷（批号：110729-201204，含量：94.5%）、哈巴俄苷（批号：110730-201106，含量：96.0%）购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯；甲醇为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.03%磷酸，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；检测波长：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10µl。在此条件下，哈巴俄苷和哈巴苷与样品中其他成分达到基线分离，色谱见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备。精密称取哈巴苷对照品20.36 mg、哈巴俄苷对照品18.30 mg，分别置于10 ml 量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，制得对照品储备液Ⅰ（含1.924 0 g/L哈巴苷）、Ⅱ（含1.756 8 g/L哈巴俄苷）。

图1 高效液相色谱图A.供试品溶液；B.阴性对照溶液；C.混合对照品；D.黄芪溶液；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷Fig 1 HPLC chromatograms A.test solution；B.negative control solution；C.mixed reference；D.astragalus solution；1.harpagide；2 harpagoside

2.2.2 供试品溶液的制备。取养阴降糖胶囊内容物约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 ml，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备。按处方比例制备及不含玄参的阴性样品，另取黄芪，同“2.2.2”项下制备方法制备阴性对照溶液及黄芪溶液。

2.3 干扰试验

取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液，分别按“2.1”项下色谱条件测定，色谱见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取对照品储备液Ⅰ、Ⅱ各100µl，置于10 ml 量瓶，加50%甲醇稀释至刻度，制成每1 ml 分别含哈巴苷19.240 2µg、哈巴俄苷17.568 0µg的混合溶液，进样1、2、5、10、20µl，记录色谱图。以峰面积（y）为纵坐标、进样量（x）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：y哈巴苷＝0.349 337x哈巴苷+0.182 619（r＝1.000 0，n＝5）；y哈巴俄苷＝1.729 49x哈巴俄苷+0.228 873（r＝1.000 0，n＝5）。结果表明，哈巴苷在19.240～384.800 ng、哈巴俄苷在17.568～351.360 ng范围内线性关系良好。

2.5 最低定量限

将对照品储备液Ⅰ、Ⅱ按逐步稀释法分别稀释，测定其最低定量限。当信噪比约为10∶1时，哈巴苷、哈巴俄苷的最低定量限分别为3.0、2.0 ng。

2.6 稳定性考察

取“2.2.1”“2.2.2”项下溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24、36、48 h测定。结果供试品溶液中哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.41%、0.23%，对照品溶液中哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为0.35%、0.68%，表明供试品溶液与对照品溶液在48 h内稳定。

2.7 精密度试验

取“2.4”项下的对照品混合溶液进样5 次，每次10µl。结果哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.21%、0.16%，表明精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批样品，按“2.2.2”项下方法制备溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定。结果哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为2.01%、2.23%，表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验

按“2.2.2”项下取样量的1/2，称取已知含量的同一批样品5份，每份加入对照品储备液Ⅰ75µl、对照品储备液Ⅱ40µl，依法制备、测定并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝5）Tab 2 Results of recovery test（n＝5）

2.10 样品测定

取6批养阴降糖胶囊按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以外标法计算含量，结果见表3。

表3 样品的含量测定结果Tab 3 Content determination results of samples

3 讨论

现代药理研究表明，养阴降糖胶囊各味药均有降糖作用，其中地黄、玄参滋阴、清热、补肝肾，黄芪、苍术益气、补脾肾。地黄配黄芪能益气、生津、止渴，可有效改善糖尿病患者口渴多饮、气短乏力等症状；玄参、苍术合用以玄参之润制苍术之燥，以苍术温燥防玄参滞腻，两药相互制约、相互促进，可减轻糖尿病患者全身燥热、口渴多饮的症状。全方诸药合用，具有益气养阴、清热降糖的功效。

玄参的特征成分为环烯醚萜类，如哈巴苷和哈巴俄苷，现行版《中国药典》已收载了两者的含量测定，但关于复方制剂中玄参的哈巴苷及哈巴俄苷含量测定鲜有报道［3-6］。本文所建立的方法合理可行，重现性、稳定性及回收率均良好，可为玄参的复方制剂如养阴降糖胶囊的含量测定提供参考。

供试品中多味药含有苷类成分，如黄芪（见图1）所含苷类成分对哈巴俄苷的测定影响较大，故选择分离方法就显得至关重要。笔者通过色谱分离及梯度洗脱，达到了简单、实用、效率高、损失少的目的。若仅测定玄参中哈巴苷及哈巴俄苷，只需乙腈-0.03%磷酸（25∶75）等度洗脱即可，无需梯度洗脱。

在供试品溶液的制备中，笔者进行了冷浸法、回流法、超声法的对比研究，结果三者无显著性差别。为保证试验效率，选择超声提取方法。笔者还考察了超声提取时间对提取率的影响，结果超声提取20 min含量已达稳定。为保证提取效率，选择提取时间为30 min。

综上，本文建立的方法专属性强，可排除其他非目标测定物的干扰，测定结果准确、相关性好，可用于该制剂质量控制。

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