荧光分光光度法测定大山楂丸中黄酮类化合物的含量Δ

王海燕，贾宝秀，臧晴晴（1.泰安市食品药品检验中心，山东泰安 71000；.泰山医学院药学院，山东泰安71016）

大山楂丸由山楂、神曲、麦芽组成，是开胃消食的常用中成药。在临床上广泛用于治疗食欲不振、消化不良、脘腹胀满等。其主要的化学成分包括多种黄酮类化合物、有机酸、维生素及各种消化酶等。目前，测定黄酮类成分的方法主要有薄层色谱法［1］、高效液相色谱法［2］、紫外分光光度法［3-4］等。荧光分析法自20 世纪70 年代起以其高灵敏度、选择性好、样品需用量少、重现性好、仪器设备简单不昂贵等特点，被广泛应用于环境、材料及药物、毒物的分析［5-12］。荧光分析法主要包括直接测定法和衍生化法。其中，衍生化法是由于药物自身无荧光或者在水溶液中的荧光强度低，无法直接测定，必须通过加入其他试剂来提高药物的荧光强度而建立的荧光分析法。

槲皮素属黄酮类代表化合物之一，本身有比较弱的荧光，但加入铝离子后，荧光发射波长发生了明显的红移，荧光强度得到很大的提高；通过紫外光谱法进一步证明二者形成了配位化合物。在此基础上，笔者建立了一种新的测定大山楂丸中黄酮类含量的荧光分光光度法，成功用于大山楂丸中总黄酮的含量测定，并且将测定结果与《中国药典》比色法进行比较，为大山楂丸的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

荧光分光光度计（日本岛津设备公司，型号：RF-5301PC）；紫外可见分光光度计（上海亚荣生化仪器厂，型号：sp-752）；电子天平（上海恒丰科学仪器有限公司，型号：MP300D）。

1.2 药品与试剂

大山楂丸（市售品，北京同仁堂股份有限公司）；槲皮素（中国食品药品检定研究院）；乙醇、盐酸、三氯化铝等试剂除另有说明外均为分析纯，水为二次去离子水。

2 方法与结果

2.1 试验方法

2.1.1 荧光光谱及荧光强度的测定。于10 ml 比色管中依次加入盐酸（0.01 mol/L）1.0 ml、一定量铝离子（Al3+）溶液，再加入槲皮素标准溶液或供试品溶液，用水定容至10 ml。设定荧光激发/发射波长为281/352 nm、激发和发射光狭缝宽度为5 nm，在300～500 nm波长范围内记录荧光光谱及荧光强度。

2.1.2 总黄酮的提取。取市售大山楂丸，切成小块，于120 ℃干燥2 h，精密称取适量，置于索氏提取器中，用95%的乙醇溶液125 ml回流提取1.5 h，将提取液转移至250 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得供试品溶液。

2.2 试验结果

2.2.1 体系的荧光光谱图。按照试验方法，扫描得到了有/无铝离子存在体系的荧光激发和发射谱图，见图1。

由图1 可以看出，在无铝离子存在的体系中，槲皮素的荧光激发和发射波长分别为274、347 nm；当体系加入铝离子后，在347 nm处的荧光峰减弱，而在437 nm处出现一个新的荧光峰，说明槲皮素和铝离子形成了络合物，共轭程度增大，荧光峰发生了红移。

图1 荧光化合物的荧光激发及发射光谱a、b.槲皮素的荧光激发和发射光谱（无铝离子体系）；c、d.槲皮素-铝络合物的荧光激发和发射光谱Fig 1 Fluorescence excitation/emission spectra of fluorescent chemicals a-b：spectra of quercetin（without aluminum ion）；c-d.spectra of quercetin-aluminum complex compound

2.2.2 试验条件的优化。本文考察了酸度（盐酸用量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 ml，见图2）、表面活性剂［曲拉通X-100（Triton X-100）、十二烷基磺酸钠（SLS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、β-环糊精（β-CD）（浓度均为1%）］、温度（室温25 ℃，水浴33、53、73 ℃）、反应时间（20、40、60、80、100 min）及铝离子浓度（1×10-4、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4、6×10-4、7×10-4、8×10-4、9×10-4、10×10-4mol/L，见图3）对体系荧光强度的影响情况。结果发现，在盐酸酸性介质中、无表面活性剂、常温下、反应30 min、铝离子浓度为2×10-4mol/L时，体系的荧光强度最大且稳定。

图2 荧光强度随盐酸用量变化Fig 2 Fluorescence intensity in relation to hydrochloric acid volume

图3 荧光强度随铝离子浓度变化曲线Fig 3 Curves of fluorescence intensity in relation to aluminum ion concentration

2.2.3 标准曲线的绘制。通过对试验条件的优化，确定了最佳试验条件，按此条件配制一系列不同浓度的槲皮素标准溶液，按试验方法测定荧光强度，结果发现槲皮素浓度（c）在0.2×10-5～1.5×10-5mol/L范围内与其荧光强度（F）呈良好的线性关系，线性回归方程为F＝500.57c-8.276 7（r＝0.995 8）。对浓度为1.0×10-5mol/L 的标准溶液进行11 次平行测定，RSD 为0.80%；根据国际理论与应用化学联合会（IUPAC）规定，cL＝KS0/S，其中cL为检测下限，K为与置信水平相关的常数，S0为11次空白溶液测定值的标准偏差（S0＝0.42），S为标准曲线的斜率，结果测得检测限为2.4×10-8mol/L。

2.2.4 加样回收率测定。为验证所建立分析方法的准确度，分别移取已知含量的样品溶液3份，分别加入不同体积的对照品溶液，进行加样回收试验，结果见表1。结果表明，利用该方法测定大山楂丸中总黄酮的含量，回收率在96%～104%之间，表明本方法准确度较好。

表1 回收率测定结果Tab 1 Determination results of recovery rate

2.2.5 样品测定。依据“2.1.2”项下样品处理方法提取了市售不同批号的大山楂丸中黄酮类成分，按上述试验方法测定总黄酮的含量，并与《中国药典》规定的比色法测定结果进行比较，结果令人满意，见表2。

表2 样品测定结果Tab 2 Determination results of samples

3 讨论

3.1 酸度的影响

当溶液体系在酸性条件下时，铝离子与槲皮素的络合作用更强，所以本体系选择在盐酸酸性介质下进行测定。酸性的强弱对体系的荧光影响较为显著，笔者考察了加入不同体积的盐酸溶液对体系荧光强度的影响。结果发现，当加入盐酸的体积为1 ml时，荧光强度最大且比较稳定，因此选择盐酸的加入体积为1 ml。

3.2 表面活性剂的影响

表面活性剂具有增溶增敏的作用。笔者考察了5 种不同的表面活性剂（Triton X-100、SLS、SDS、CTAB、β-CD）对槲皮素-铝络合物荧光强度的影响。结果发现，加入表面活性剂前后，体系的荧光强度没有明显的增强，故本试验中选择不加表面活性剂。

3.3 温度的影响

温度是影响荧光强度的一个重要的因素。笔者考察了不同温度（25、33、53、73 ℃）对体系荧光强度的影响。结果发现，随着温度的升高，体系荧光强度显著降低，初步判断应该是发生了荧光猝灭现象，因此选择在室温下进行测定。

3.4 反应时间的影响

笔者考察了不同反应时间（20、40、60、80、100 min）对体系荧光强度的影响。结果发现，体系荧光强度在20～40 min 内最高且基本保持稳定；在40 min之后，荧光强度呈缓慢下降趋势，因此选择放置30 min后进行测定。

3.5 铝离子浓度的影响

铝离子的浓度直接影响络合反应的完全程度，从而影响体系荧光强度。笔者考察了不同浓度铝离子对体系荧光强度的影响，如图3所示，随着铝离子浓度的增大，荧光强度随之增加。当铝离子浓度为2×10-4mol/L，体系的荧光强度最大且稳定，故选择铝离子浓度为2×10-4mol/L。

综上，铝离子的加入，可使槲皮素的荧光发射光谱发生较大的红移，且荧光强度明显增强。在此基础上，以铝离子作为络合试剂，通过优化试验条件，建立了一种新的测定总黄酮含量的荧光分光光度法，成功用于大山楂丸中总黄酮的测定，与《中国药典》规定的比色法相比，灵敏度大大提高。本研究可为活性成分为黄酮类化合物的中药材质量控制提供依据。

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