李洪军 王 均
药物治疗仍然是肿瘤治疗的主要手段之一,但面临诸多挑战[1]。1)药物选择性不强,导致严重的不良反应;2)对耐药性肿瘤细胞无效;3)对转移癌的疗效差。开发安全有效的纳米载体将药物输送到肿瘤[2-3],有利于改变药物的药代动力学和生物体内分布[4],增强药物的选择性,提高其利用率。相对于传统药物基于纳米载体的药物具有以下优势[5]:1)对药物有保护作用,可避免其被降解,并增加药物的溶解性;2)阻止药物与生物环境发生相互作用;3)延长药物的血液循环时间,有助于药物在肿瘤组织富集;4)增强细胞对药物的摄取[6]。
目前约有250种基于纳米载体的药物进入临床试验阶段,部分已用于临床治疗。但基于纳米载体药物的发展依受诸多限制,最主要是当载体进入体内后难以控制其药物释放行为,导致在肿瘤部位的药物积累不足[7]。针对该难题,开发了新一代“智能型”纳米药物载体,可在外源性或内源性的一些刺激条件下,通过改变其理化性质提高药物的输送效率。常用的刺激因素包括pH变化、还原环境、酶环境、温度和光等[8];其中pH的变化应用最为广泛,主要是因为不同器官、组织以及细胞器具有不同的pH环境,可作为一种内源性刺激因子,而不需借助外源性刺激[9]。
肿瘤的酸性微环境是其一个显著特征,利用pHe作为刺激因子提高纳米载体的靶向效率,是一种重要治疗策略[10],两种主要方式是药物在肿瘤部位响应性释放和癌细胞对纳米粒的摄取增加[11]。合理设计的纳米粒可在血循环中保持稳定,通过EPR效应在肿瘤部位累积,被pHe活化后,纳米粒释放药物,或与癌细胞的相互作用增强使载体的摄取增加。图1描述了3种不同的pHe活化的纳米药物载体系统[12-13]。
典型的pHe激活药物载体系统是基于聚-L-组氨酸的pH敏感高分子胶束。聚-L-组氨酸上咪唑环的pKb约为6.5,能通过离子化使聚合物发生亲疏水部分比例的转变[14-16]。该研究发展了一种基于poly-His-b-PEG和(PLLA)-b-PEG特定比例的混合胶束,在pH>7.4的条件下能够保证颗粒在血液中的长循环以及包载药物的不必要释放、而当pH<7.0时,胶束内部的polyHis离子化导致颗粒不稳定,加速携载药物释放。相比于非pH敏感对照组,该系统对肿瘤抑制效果显著,肿瘤体积在50 d后仅增长到约为300 mm3,抑制效果接近80%。
另一种用于肿瘤酸度响应的药物输送方式是通过pHe触发的屏蔽/去屏蔽化转换实现配体的二次激活。Bea等[8]研究组报道了基于pHe触发的配体二次激活的多肽(TAT)修饰的胶束药物载体系统。将细胞膜穿透肽TAT键合在PLLA-b-PEG的PEG末端并组装成纳米粒,证明在pH>7.0条件下,TAT表面的正电荷与带负电荷的聚甲基丙烯酰氯磺胺地托辛(PSD)和PEG嵌段共聚物(PSD-b-PEG)通过电荷相互作用结合,从而将TAT屏蔽,此时颗粒表面电势为中性;当pH降低到肿瘤酸度时,PSD去离子化,PSD-b-PEG保护层脱落,颗粒转变为正电性并且将TAT再次暴露在纳米粒表面,从而增强癌细胞对纳米粒的摄取能力。在细胞水平的实验也验证了在肿瘤酸度环境下屏蔽的胶束体系更容易被肿瘤细胞所摄取,从而增加治疗效果[17]。
图1 3种酸度活化的纳米载体示意图Figure1 Schematic diagram of three tumor extracellular pH environment(pHe)-activated nanocarriers
上述基于pHe响应的纳米载体表现为癌细胞外药物释放,不利于杀伤耐药细胞或运载核酸类药物。表面带正电荷的纳米粒与细胞膜相互作用增强,有利于细胞摄取纳米粒;但带正电荷的纳米粒很快与血液中的蛋白质相互作用,使其在血循环中聚集被快速清除,难以到达靶部位。针对该难题的设计策略是,在正常生理条件下,纳米粒在血循环中保持惰性,在实体瘤中通过渗透增强和滞留效应(EPR)富集纳米粒,进而被肿瘤pHe活化,表面转变为正电荷,增强与细胞膜的相互作用,提高细胞摄取和药物疗效[18-20]。
Du等[21]最早设计了一种可在pHe下发生表面电荷反转的纳米凝胶PAMA-DMMA,其发生电荷反转后被细胞的摄取能力显著增强。该研究先通过反向微乳液法制备了氨基官能化的纳米凝胶,带正电荷,然后用2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)对氨基进行修饰,获得表面带大量羧基的纳米凝胶,带负电荷;所形成的酰胺键在中性、碱性条件下稳定,而在微酸性环境下则快速降解,重新暴露出氨基,使纳米凝胶带正电荷,从而增强肿瘤细胞对纳米粒的摄取(图2)。
实验证明,该纳米凝胶在pH为7.4下呈负电性,几乎不吸附牛血清白蛋白(BSA),提示有可能实现长循环并通过EPR效应在肿瘤部位富集,而在肿瘤pHe下,PAMA-DMMA纳米粒在30 min内迅速从负电性转变为正电性,人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435s的摄取量显著增加。在体内水平的实验中,在原位注射到肿瘤部位后通过肿瘤组织切片观察,PAMA-DMMA能够有效进入肿瘤细胞并分散在胞浆内;相反,不具备电位反转能力的对照纳米凝胶PAMA-SA则更多只是黏附在细胞膜上而不能有效进入细胞。
图2 电荷反转及非电荷反转型纳米胶PAMA-DMMA/PAMA-SA示意图Figure2 Schematic diagram of the performances of drug-loaded pH-responsive charge-reversal PAMA-DMMA nanogels and non-charge-reversal PAMA-SA nanogels
肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源[22-23],也是肿瘤耐药的主因[24]。杀灭CSC是治疗肿瘤的新策略[25]。为达此目标,纳米载体需要被CSC大量摄取,且在胞内有效释放,大幅度提高胞内有效药物浓度。
Du等[26]设计了对两种pH有序响应的聚合物-阿霉素键合纳米药物(PPC-Hyd-DOX-DA),其中聚合物主链为PEG化的聚磷酸酯,聚磷酸酯的侧基经DMMA修饰,使纳米药物具有肿瘤酸度响应性;同时,阿霉素分子也通过腙键键合到聚磷酸酯链段的侧基,从而具有对内涵体/溶酶体酸性的响应性(图3)。
结果表明,PPC-Hyd-DOX-DA纳米药物在pH为6.8时进入细胞的能力明显高于pH为7.4时;进入细胞后,键合DOX的腙键在内涵体pH(~5.0)中被破坏,使DOX从载体中释放,进入细胞核中发挥抗癌作用。肿瘤干细胞球囊生长实验显示,PPC-Hyd-DOX-DA纳米粒显著抑制球囊生成。与之相比,只对单一酸度敏感的对照PPC-Hyd-DOX-SA(只对内涵体/溶酶体酸度敏感)或PPC-Ami-DOX-DA(只对肿瘤酸度敏感),均不能有效抑制球囊生成。该研究提示,双重pH敏感和反转纳米颗粒表面电荷的策略对耐药性的肿瘤干细胞有明显优势。
图3 双pH响应的聚合物-阿霉素(DOX)键合药物(PPC-Hyd-DOX-DA)结构和pH触发的增强细胞内吞和胞内药物释放示意图Figure3 Chemical structure of the dual pH-responsive polymer-DOX conjugate(PPC-Hyd-DOX-DA)and schematic diagram of its pH-triggered cellular internalization and intracellular drug release
两性离子聚合物被认为是可能替代PEG的新材料,通常用于纳米粒的亲水部分延长其在体内循环并更好地在肿瘤富集。但两性离子纳米粒与细胞膜相互作用较弱,致其难以被细胞摄取,从而限制其应用。
Yuan等[27]设计了基于对肿瘤酸度敏感的两亲性嵌段聚合物PCL-b-P(AEP-g-TMA/DMA)纳米粒,聚两性离子结构为纳米粒的亲水外壳。在血液pH值条件下,该纳米粒表面电势为中性,抗血液蛋白黏附力强,使其具有较长的血液循环时间。当纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤组织后,微酸性环境使聚两性离子结构发生改变,纳米粒的表面电势迅速转变为正电性,从而增强细胞对纳米粒摄取(图4)。在与蛋白结合的模拟实验中,该纳米粒在pH为7.4的条件下基本不与蛋白结合,而在pH为6.8的条件下与蛋白的结合作用较强。体外和体内实验研究表明该纳米粒在肿瘤微酸的环境下更容易被肿瘤细胞所摄取,而作为对照的非敏感的纳米粒的内吞能力则较弱。在动物水平的肿瘤抑制实验也表明酸敏感两性离子聚合物表面化的纳米颗粒具有更强的肿瘤抑制作用。
图4 基于pH响应的表面电荷反转两性离子聚合物纳米粒用于包载阿霉素示意图Figure4 Schematic diagram of DOX-loaded zwitterionic polymer-based NPs and the changing of the surface-charge property in response to pHe
siRNA有望成为重要的肿瘤治疗策略[28-29],但关键是如何有效将siRNA输送到肿瘤组织并增强肿瘤细胞对siRNA的摄取[30]。Yang等[31]使用二硫键交联的聚乙烯亚胺ssPEI800和siRNA形成带正电的纳米颗粒ssPEI800/siRNA,然后通过静电作用将阴离子型聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段聚合物(PPC-DA)包覆到颗粒表面,形成表面PEG覆盖的纳米粒。PPC-DA在肿瘤微酸性环境下迅速降解,触发高分子的电荷反转,使高分子与ssPEI800/siRNA复合的纳米粒“脱壳“,重新暴露出带正电荷的ssPEI800/siRNA颗粒,显著增加肿瘤细胞的摄取,提高RNA干扰的效率(图5)。在细胞水平和动物水平的实验表明,具有酸度敏感的纳米粒(S-NP)在肿瘤部位酸度条件下能够更有效地被肿瘤细胞摄取并特异性沉默靶基因的表达,而肿瘤生长抑制实验也表明S-NP能够更加有效携载siRNA对肿瘤进行治疗。
在过去的十年里,环境响应性纳米粒作为智能型药物载体取得了显著进展。本文重点介绍了几种肿瘤酸度pHe响应的纳米载药体系,这类体系在正常的生理条件下可保持稳定,而在肿瘤部位的微酸性环境下发生化学结构的改变,从而影响纳米载体的性能,可以促进药物的释放,增强细胞对颗粒的摄取,减少药物在其他组织器官中的分布等。
值得注意的是,虽然这种pHe响应性纳米载药体系在用于肿瘤治疗方面已经取得了明显的效果,但仍有许多问题需要解决。首先,需要对肿瘤微环境的物理化学和生物特性以及纳米粒在肿瘤微环境中的变化进行更深入地研究;其次,基于响应性纳米载体给药体系需要更多基于动物水平的独立的研究,以及对药物代谢动力学的更加深入地研究;再次,除了细胞摄取和胞内药物释放之外,另外一个基于纳米给药体系的重要因素就是肿瘤渗透。总而言之,刺激响应性材料为更加有效的靶向性肿瘤治疗提供了新的机遇,并且刺激响应性纳米载体在肿瘤治疗中也具有良好的应用前景。
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