东北野豌豆族植物叶形态结构的研究及其分类学意义

史传奇，刘玫，王臣，张欣欣，程薪宇

（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨150025）

野豌豆族（tribe Vicieae）包括5属，300余种，为一年生或多年生草本，叶多为偶数羽状复叶，稀为奇数羽状复叶，叶轴顶端具卷须或少数变为刺毛状［1－4］。东北产野豌豆族植物包括3属：山黧豆属（Lathyrus）包括9种及1变种；豌豆属（Pisum）包括1种；野豌豆属（Vicia）包括14种、4变种及7变型［5－6］。

叶片及叶柄结构是植物相对保守和稳定的特征，如叶形态、叶表皮细胞及附属物和叶柄横切面结构等常被作为研究系统学与分类学的重要依据［7－17］。Leht［18］将山黧豆属植物小叶叶形划分为线形、椭圆形、倒卵形及卵形，叶柄无翼、具狭翼或宽翼，并指出黄金山黧豆（Lathyrusaureus）小叶具腺毛。郑太坤等［19］研究4种野豌豆属植物表明，山野豌豆（Viciaamoena）、黑龙江野豌豆（V．amurensis）和大叶野豌豆（V．pseudorobus）均具椭圆形小叶，而广布野豌豆（V．cracca）小叶为披针形。张雪梅［20］观察5种豆科植物叶表皮微形态，将垂周壁式样分为平直、平直－弓形、浅波形和深波形，并认为豌豆（Pisumsativum）与蚕豆（Viciafaba）均具不等型气孔。Rodriguez［21］认为叶柄近轴面出现沟槽相对进化，叶柄内维管束排列方式的进化顺序为圆形－U形－V形。Lewis等［3］基于形态学与分子系统学数据分析表明山黧豆属、豌豆属与野豌豆属之间，前两者具有较近的亲缘关系。

迄今为止，尚未见关于东北野豌豆族植物叶解剖结构的详细研究。本研究旨在通过对东北野豌豆族20余种植物叶外部形态与解剖结构的观察，为进一步研究豆科植物分类及系统学提供形态学基础资料。

1 材料与方法

1．1 材料

研究材料为东北野豌豆族3属（山黧豆属、豌豆属和野豌豆属），22种，2变种及1变型。新鲜材料于2012－2013年采自于中国东北部，经哈尔滨师范大学王臣教授鉴定。凭证标本存放于哈尔滨师范大学植物标本馆（Harbin Normal University，HANU），干材料于2013年取自于东北生物标本馆（Institute of Forestry and Pedology，IFP）。物种名称，凭证标本及采集地等信息详见表1。

1．2 方法

扫描电镜：参照陈曦等［22］的方法，成熟叶片切取长方形（5mm×3mm），用双面胶将样品粘在样品台上，之后，用Eiko IB－3离子溅射仪导电处理，溅射镀膜7～8nm厚，在Hitachi S－4800型扫描电子显微镜下（加速电压为5千伏）观察毛状体并照相。

叶片透明：参考任海燕等［23］的方法，每个物种取来自两植株的成熟叶片，应用5%NaOH水溶液透明叶片不少于24h，用50%甘油水溶液制成临时装片，重复3次，经Olympus BX53显微镜观察气孔分布及形态，Olympus DP26成像系统照相，气孔类型的鉴定参照Dilcher系统［24］。

表1 东北野豌豆族物种（用于叶特征研究）、分类地位、凭证标本及采集地［5］Table 1 Taxa of the tribe Vicieae in northeastern China examined for leaf characters，together with taxonomic status，voucher specimen details and locality

GMA（glycol methacrylate，乙二醇甲基丙烯酸酯）切片：新鲜材料用FAA（Formalin－alcohol－acetic acid mixture，福尔马林－乙醇－冰醋酸混合液）固定，取自标本的材料放入热水中约30min，待材料充分吸水膨胀后，用FAA固定，时间不少于24h，每个物种取自两植株叶柄的中部，叶柄极短的物种取基部叶轴的中部。材料经50%乙醇、100%乙醇、异丙醇、正丁醇系列脱水处理各2次（每次12h）后进入GMA渗透3次，前2次各为1d，第3次5～7d。之后将材料及GMA装入胶囊，置于60℃温箱24h进行聚合［25］。用Leica Ultralcut R切片，厚度2～3μm。根据Feder和 O’Brien［25］的方法，切片首先置于 DNPH（2，4－Dinitrophenylhydrazine，2，4－二硝基苯肼）冰醋酸水溶液30min，流水冲洗8～10min，转置于高碘酸10min，流水冲洗5min后将切片烘干，置于Schiff试剂30min，流水冲洗1～2min，最后用甲苯胺蓝染色1～2min，流水冲洗5～10min，切片烘干后用加拿大树胶封片。切片同样用Olympus BX53显微镜观察及Olympus DP26成像系统照相。

2 结果与分析

本研究观察并描述了东北野豌豆族叶的形态结构特征，具体结果详见表2。

2．1 叶的形态

图1 东北野豌豆族叶形Fig．1 Leaf shape of tribe Vicieae in northeastern China

山黧豆属、豌豆属和野豌豆属植物的叶均为偶数羽状复叶，但小叶的数目有所不同，多数物种具2～6对小叶（图1A，E），香豌豆（图1B）、牧地山黧豆（图1C）和歪头菜（图1H）只具1对，五脉山黧豆植株上部具2～3对（图1D1），而下部只具1对（图1D2），广布野豌豆（图1F）多达10余对。叶轴顶端分为2种形态：分歧（图1B）或单一（图1C）的卷须和刺状（图1G，H）。大山黧豆（图1A）和五脉山黧豆（图1D1）植株的中上部叶的叶轴顶端形成卷须，而下部为刺状（图1D2）。小叶叶形有4种：卵形、椭圆形（如大山黧豆、豌豆，图1A，E）、披针形或线形（如牧地山黧豆、五脉山黧豆，图1C，D）。豌豆的托叶为叶状（图1E），而山黧豆属和野豌豆属多为箭头形或半箭头形（图1B～D，F，G），但形态差异较大。

2．2 叶表皮细胞及附属物特征

多数物种叶表面及叶缘具毛状体，毛状体分为两类：单细胞非腺毛（如山野豌豆叶上表面，图2A）和多细胞腺毛（如山野豌豆叶下表面，图2B）。豌豆叶的上、下表面及叶缘均无毛。单细胞非腺毛存在于多数山黧豆属及野豌豆属植物，且后者还具多细胞腺毛。叶表皮细胞垂周壁主要分为两种类型，多为波形（如豌豆叶下表面、山野豌豆叶下表面，图2C，D），少为弓形（如五脉山黧豆叶下表面，图2E）。上、下表皮细胞垂周壁特征相同，偶见不同，如黑龙江野豌豆上表皮的为弓形，而下表皮的为波形。气孔包括3种类型：不等型、无规则型和平列型。山黧豆属及豌豆属的气孔主要为不等型（图2B，C），前者少见无规则型和平列型，后者偶见平列型。野豌豆属气孔主要为无规则型（图2A），少数为不等型，偶见平列型。气孔可分布于叶片的上、下表面（如豌豆和山野豌豆），或只分布在下表面（如大山黧豆和歪头菜）。

2．3 叶柄结构

叶柄横切面性状有4种类型：近倒三角形、戟形、心形和圆形。山黧豆属叶柄横切面为近倒三角形，如大山黧豆（图3A）、五脉山黧豆（图3D）等，或为戟形，如香豌豆（图3B）和山黧豆（图3C），前者具翼。野豌豆属为戟形（图3F1，G）或心形（图3H）。两属的叶柄近轴面均具沟槽，山黧豆属较野豌豆属的沟槽浅。豌豆叶柄横切面为近圆形而无沟槽（图3E）。叶柄表皮细胞1层，紧密排列且外壁平滑，无明显角质层。表皮下由2～4层薄壁细胞构成的皮层，内含大量淀粉粒。位于棱角处的皮层细胞形成厚角组织，淀粉粒较少或无。山野豌豆和狭叶山野豌豆细胞内可见单宁（图3F2）。叶柄大维管束数目5，7或为多数。山黧豆属维管束数目为5或7，相对较大、韧皮部外侧有韧皮纤维且位置稳定（图3A～D），豌豆的大维管束多于7（图3E），野豌豆属的通常为5（图3F～H）。维管束韧皮部与木质部之间通常可见2或3层形成层细胞（图3F2）。维管束通常排列为V形（图3D，F～H），或近轴面沟槽附近亦见维管束排列的心形（图3A～C），豌豆叶柄维管束排列为圆形。山黧豆属的大山黧豆（图3A）、豌豆属的豌豆（图3E）和野豌豆属的蚕豆（图3G）等的叶柄具髓腔。

图2 东北野豌豆族叶表皮毛状体及气孔Fig．2 The leaf trichome and stoma of tribe Vicieae in northeastern China

图3 东北野豌豆族叶柄结构Fig．3 The petiole structure of tribe Vicieae in northeastern China

2．4 检索表

根据所研究物种的叶形，小叶数，毛状体，气孔类型及分布，叶柄结构等特征制平行检索表。

2．4．1 东北野豌豆族检索表

1．气孔主要为无规则型，叶柄大维管束为5………………………………………………………… 野豌豆属Vicia

1．气孔主要为不等型，叶柄大维管束5，7或更多……………………………………………………………………2

2．叶柄横切面为圆形，近轴面无沟槽 ………………………………………………………………… 豌豆属Pisum

2．叶柄横切面不为圆形，近轴面有沟槽 ………………………………………………………… 山黧豆属Lathyrus

2．4．2 东北山黧豆属检索表

1．叶柄具髓腔 …………………………………………………………………………… 大山黧豆Lathyrusdavidii

1．叶柄无髓腔 …………………………………………………………………………………………………………2

2．叶柄具翼，上和下表皮垂周壁样式不一致 …………………………………………………… 香豌豆L．odoratus

2．叶柄不具翼，上和下表皮垂周壁样式一致…………………………………………………………………………3

3．叶柄横切面为戟形 …………………………………………………………………………………………………4

3．叶柄横切面为近倒三角形 …………………………………………………………………………………………5

4．小叶为1对，叶柄维管束排列为V形 ………………………………………………… 牧地山黧豆L．pratensis

4．小叶多于1对，叶柄维管束排列为心形……………………………………………………………………………6

5．叶上及下表皮细胞垂周壁为弓形，气孔分布于叶上及下表面 ………………… 五脉山黧豆L．quinquenervius

5．叶上及下表皮细胞垂周壁为波形，气孔仅分布于叶下表面………………………………………………………7

6．叶为披针形或线形，气孔为不等型及无规则型 ……………………………… 山黧豆L．paluatrisvar．pilosus

6．叶为卵形或椭圆形，气孔为不等型及平列型………………………………………………………………………8

7．叶柄大维管束数常为5，多细胞腺毛仅分布于叶下表面 ……………………………… 东北山黧豆L．vaniotii

7．叶柄大维管束数常为7，多细胞腺毛分布于叶两面 ………………………………… 三脉山黧豆L．komarovii

8．叶表皮细胞垂周壁为波形，叶表面无毛 …………………………………………………… 矮山黧豆L．humilis

8．叶表皮细胞垂周壁为弓形，叶表面具毛 ……………………………………………… 海滨山黧豆L．maritimus

2．4．3 东北野豌豆属检索表

1．叶柄维管束排列为心形 ……………………………………………………………………………………………2

1．叶柄维管束排列为V形 ……………………………………………………………………………………………3

2．小叶5～7对，气孔只分布于叶下表面，叶柄横切面为戟形 ……………………… 东方野豌豆Viciajaponica

2．小叶2～5对，气孔分布于叶上及下表面，叶柄横切面为心形 …………………… 大叶野豌豆V．pseudorobus

3．叶上表皮细胞垂周壁为弓形，下表皮为波形 ……………………………………… 黑龙江野豌豆V．amurensis

3．叶上及下表皮细胞垂周壁均为波形 ………………………………………………………………………………4

4．气孔为无规则型 ……………………………………………………………………………………………………5

4．气孔具无规则型及其他类型 ………………………………………………………………………………………6

5．叶柄横切面为戟形 …………………… 山野豌豆V．amoena（狭叶山野豌豆var．oblongifolia小叶为线形）

5．叶柄横切面为心形 …………………………………………………………………… 多茎野豌豆V．multicaulis

6．叶柄具髓腔 …………………………………………………………………………………………………………7

6．叶柄无髓腔 …………………………………………………………………………………………………………8

7．叶轴顶端为刺状，叶缘无毛 ………………………………………………………………………… 蚕豆V．faba

7．叶轴顶端为卷须，叶缘有单细胞非腺毛……………………………………………………………………………9

8．气孔分布于叶的上及下表面 ………………………………………………………………………………………10

8．气孔只分布于叶的下表面…………………………………………………………………………………………11

9．小叶4～8对，叶片上表面具单细胞非腺毛和腺毛 ……………………………………… 救荒野豌豆V．sativa

9．小叶3～4对，叶片上表面只具单细胞非腺毛，无腺毛 …………………………………… 大花野豌豆V．bungei

10．叶轴顶端为刺状，叶片下表面无毛 ……………………………………………………… 柳叶野豌豆V．venosa

10．叶轴顶端为卷须，叶片下表面有毛………………………………………………………………………………12

11．小叶2～3对，叶柄横切面为戟形 ………………… 北野豌豆V．ramuliflora（贝加尔野豌豆f．baicalensis）

11．小叶仅1对，叶柄横切面为心形 …………………………………………………………… 歪头菜V．unijuga

12．小叶5～12对，叶柄横切面为戟形 ……………………………………………………… 广布野豌豆V．cracca

12．小叶3～5对，叶柄横切面为心形 ………………………………………………… 索伦野豌豆V．geminiflora

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3 讨论

本研究的东北野豌豆族植物的叶外部形态（小叶数目、叶形及叶轴顶端）与前人报道基本相同［3－6，10－12，18－19］，可作为种间的分类依据。豌豆的托叶为叶状，山黧豆属和野豌豆属的托叶为箭头状或半箭头状，但形态变化很大，我们观察到不仅在种间，在同一植株不同部位的托叶也有差异，因此认为托叶不宜作为野豌豆族植物的分类依据。野豌豆族植物叶表面无或具稀疏非腺毛［3－6，26－28］。Leht［18］报道山黧豆属小叶具腺毛，本研究同样发现山黧豆属的几个种和野豌豆属多数种具多细胞腺毛。成熟叶片毛状体的类型与分布比较稳定，可作为种间的分类依据。张雪梅［20］指出豌豆的上及下表皮细胞垂周壁为浅波形，蚕豆的为深波形，作者认为野豌豆族植物中浅波与深波之间有过渡类型，界限不明显，故将表皮细胞垂周壁分为弓形和波形两类。山黧豆属、豌豆属和野豌豆属具不同类型的气孔，并且在同一叶片上的气孔类型也不同，经重复观察，前两者以不等型气孔为主，而野豌豆属多为无规则型，说明气孔在属间的分类具有一定的意义。Antonielli等［29］认为阴生植物气孔多分布于叶片上表面，但本研究显示林下的物种气孔多分布在叶片下表面（如大山黧豆、北野豌豆），这可能有利于植物在林下更好地进行光合作用。山黧豆属和野豌豆属的叶柄近轴面都具有沟槽，但前者的稍浅，豌豆叶柄近轴面无沟槽，横切面为近圆形，具多个不定数的大维管束，与前两属差别较大，可作为属间的分类依据。叶柄内髓腔的有无和维管束排列方式等特征因种而异，属间有交叉，可以作为区分属下不同种间的分类依据。

野豌豆属植物形态变化多样，分类存在较大的争议［26］。傅沛云［6］认为狭叶山野豌豆的小叶为长圆形或长圆状线形，有时为近线形而作为山野豌豆的变种。李瑞军等［30］和夏振岱［26］也赞成这一观点。苏亚拉图等［27］根据狭叶山野豌豆和山野豌豆的花粉性状、萌发孔类型等特征极为相似，且同一植株上小叶叶形不易划分出矩圆形或长披针形而将前者并入后者。通过对多份样品的比较研究，发现两者叶表面毛状体、气孔类型等特征一致，但小叶叶形明显不同，故支持将狭叶山野豌豆作为山野豌豆变种的处理。傅沛云［6］根据花轴不分枝、比叶长或稍短等特征将贝加尔野豌豆作为北野豌豆的变型。苏亚拉图等［27］观察在同一植株上同时存在分枝和不分枝的花序，赞成蒋尤泉［31］将两者合并处理为北野豌豆。本研究认为两者叶表面气孔类型、叶柄横切面等叶的特征一致，支持将两者合并为北野豌豆的观点。

Rodriguez［21］认为叶柄的进化方式为横切面为圆形的叶柄较为原始，在圆形叶柄近轴面发育出沟槽的更为进化。维管束排列从圆形到U形，再到V形。根据本研究结果可知，豌豆属的豌豆叶柄为较原始的圆形，山黧豆属和野豌豆属的叶柄近轴面具沟槽，较为进化。本研究没有观察到维管束排列成U形。作者认为山黧豆、大叶野豌豆等的维管束排列成心形应是介于圆形和U形之间的过渡类型，即叶柄维管束排列的进化方式为圆形－心形－U形－V形。Lewis等［3］指出与野豌豆属相比，山黧豆属与豌豆属的亲缘关系较近。结合叶柄结构我们推断野豌豆族的山黧豆属、豌豆属和野豌豆属中，豌豆属较为原始，而野豌豆属较为进化。

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