液相色谱-电喷雾飞行时间质谱法同时测定虫生真菌菌丝中16种游离氨基酸*

刘肖肖，李淑林，陆瑞利，罗飞飞，胡丰林

1(安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽合肥，230036)

2(安徽农业大学应用化学系，安徽合肥，230036)

虫生真菌(entomogeneous fungi)是一种以昆虫为寄主的内生真菌，具有有性型和无性型两种存在形式。虫草属中的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)和蛹虫草(Cordyceps militaris)以及它们的无性型中国被毛孢(Hirsutella sinensis)和蛹拟青霉(Paecilomyces militari)［1-2］已被广泛地用于保健食品和药品［3-4］。目前关于虫草及其无性型的研究主要集中在甘露醇、核苷、多糖、抗氧化和抗肿瘤等活性成分［5-7］，而缺乏对虫草及其无性型中的游离氨基酸组成的系统研究。游离氨基酸是食品中可以被人体直接吸收的重要营养物质，同时又是食品中主要的风味物质，因此，测定虫草及其无性型中各种游离氨基酸的含量，将可作为评价该类真菌的食用和保健价值的重要指标。

由于多数氨基酸不具有紫外吸收和荧光检测的发色基团，所以当用传统的液相色谱或氨基酸分析仪测定氨基酸含量时，首先要对氨基酸进行衍生化处理，分析过程较复杂［8］，同时衍生化处理容易形成非目标衍生物，从而影响氨基酸测定的准确性。相比较而言，近年来应用越来越普及的液相色谱与飞行时间质谱联用技术［9-10］，具有较高的分辨率和检测的灵敏度，对样品的检测限可以达到纳克级，远高于普通的HPLC方法;同时能够对样品中特定组分单独提取分析，可有效地避免在HPLC上出现的重叠峰的干扰;样品无需进行衍生化处理，实验过程简单，准确性高，然而目前尚无以之对虫生真菌中游离氨基酸进行分析检测的报道。因此，本文拟采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱(LC-ESI-TOF-MS)联用分析法，建立一种简捷，高效及高灵敏度的测定虫生真菌中游离氨基酸含量的方法，为虫生真菌中游离氨基酸的检测、资源利用和食用质量评价提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 供试菌株

中国被毛孢(Hirsutella sinensis)菌株号为RCEF5042;蛹拟青霉(Paecilomyces militari)菌株号为RCEF0720;古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)菌株号为RCEF0199;蝉棒束孢(Isaria cicadae)菌株号为RCEF4777;细脚棒束孢(Isaria tenuip)菌株号为RCEF4256;戴氏绿僵菌(Metarhizikum taii)菌株号为RCEF4127;粉被玛利亚霉(Mariannaea puinosa)菌株号为RCEF4695，由安徽农业大学虫生真菌研究中心提供。

1.1.2 材料与试剂

色谱纯甲醇，色谱纯乙腈，色谱纯甲酸，均购于美国Tedia公司;16种氨基酸(分析纯):脯氨酸(Pro)，缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，赖氨酸(Lys)，甲硫氨酸(Met)，组氨酸(His)，苯丙氨酸(Phe)，精氨酸(Arg)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Try)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，购于中国药品生物制品鉴定所。

1.1.3 主要仪器

高分辨液质联用分析仪(Agilent 6210 time of flight LC/MS)，包括 Agilent1100高效液相色谱(HPLC)，二极管阵列检测器(DAD)，飞行时间质谱仪(TOF)和电喷雾离子源(ESI)，购于美国Agilent公司;供试分析型高效液相色谱柱有Agilent Eclipse XDB-C18(2.1 mm ×150 mm，5μm)、Waters Xterra MS C18(2.1 mm ×150 mm，3.5μm)和 Phenomenex Synergi Hydro-RP(4.6mm ×250mm，4μm)，分别购于Agilent、Waters和 Phenomenex公司;AN0635 电子天平，购于上海民桥精密科学仪器公司;FreeZone12冷冻干燥系统，购于美国Labonconco公司;2K-15超速离心机，购于Sigma公司;KQ5 200DE型数控超声波清洗器，购于昆山市超声仪器有限公司;SimplicityRUV超纯水系统，购于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配置

精确称取16种氨基酸标准品，溶解于30%的甲醇水溶液，分别得到混合标准溶液Ⅰ(含脯氨酸(Pro)，缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，赖氨酸(Lys)，甲硫氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg)，它们的浓度均为500 μmol/L);混合标准溶液Ⅱ(含丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，胱氨酸(Cys)，组氨酸(His)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Try)，它们的浓度均为125 μmol/L)。这些标样在测定前用30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)稀释成系列浓度的标准溶液，以进行标准曲线绘制。

1.2.2 样品前处理

精确称取各虫生真菌固体培养菌丝体的冻干粉200 mg，溶于4 mL 30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)，25℃超声提取30 min，1 2000 r/min离心10 min取上清液，即得50 mg/mL的待测样品溶液。制备好的氨基酸标准溶液及样品溶液在4℃暂存备用，保存时间不得超过 24 h［10-11］。

1.2.3 色谱条件

进样体积:5 μL;流速:0.60 mL/min;柱温箱:25℃;供试流动相体系为含0.1%甲酸的甲醇水体系和乙腈水体系，采用梯度洗脱，洗脱梯度为:0～8 min由100%的流动相A(水相)洗脱;8～15 min流动相B(有机相)比例由0%增加到15%;15～23 min流动相B由15%增加到20%;23～30 min流动相B由20%增加到50%。

1.2.4 质谱条件

电喷雾(ESI)离子源的雾化气压:0.24 MPa(35psi);氮气流速:12.0 L/min;毛细管温度:325℃;离子扫描范围(m/z):50～1000;阴离子模式下离子化电压:3 500 V;碎片电压:175 V;阳离子模式下离子化电压:4 000 V;碎片电压:250 V。

2 结果与分析

2.1 色谱柱及色谱条件初步选择

由于氨基酸是极性较强的化合物，因此初步选择了3个适合极性化合物分析的高效液相色谱柱进行初步比较，结果发现当以Phenomenex Synergi Hydro-RP色谱柱，以乙腈水为流动相时分离效果最好。具体流动相条件为:A相为0.1%甲酸水溶液;B相为0.1%甲酸乙腈溶液;流动相梯度为:0～8 min用100%A相洗脱;8～15 min B相由0%增加到15%;15～23 min B相由15%增加到20%;23～30 min B相由20%增加到50%。

2.2 质谱条件的确定

实验分别测定了16种氨基酸在阳离子模式和阴离子模式下的电离情况，结果显示:16种氨基酸标准品在阳离子模式下的主要离子碎片为脱羧基、脱氨基和脱水后形成的离子，即［M-HCOOH+H］+、［MH2O+H］+或［M-NH3+H］+;同时，含支链氨基酸的支链会发生不同程度的断裂，芳香类氨基酸还会产生多种苯基离子碎片，离子种类较复杂，不利于定量分析。而在阴离子模式下，16种氨基酸的离子碎片主要为准分子离子峰［M-H］-，离子碎片专一，稳定性高，增加了检测的灵敏度和定量范围，可见采用阴离子分析模式较好。

阴离子模式下测定的16种标准氨基酸的质谱参数见表1。

表1 16种氨基酸在阴离子模式下的质谱参数Table 1 Mass spectra data of 16 amino acids detected under negative ionization mode

2.3 氨基酸标准品的定性及定量分析

2.3.1 氨基酸标准品的定性分析

在阴离子模式下，将16种氨基酸标准溶液单独进样得到各种氨基酸准确的质谱图(见图1)。根据质谱图提供的离子碎片，可确定各氨基酸最优的定量离子均为准分子离子峰(见表1)。虽然亮氨酸和异亮氨酸具有相同的分子离子，但亮氨酸和异亮氨酸的出峰时间不同，先出峰为异亮氨酸，据此可对二者进行准确分析。此外，缬氨酸的准分子离子(m/z)为116.072与色氨酸的吲哚基离子(m/z:116.050)质荷比接近，但二者的色谱保留时间不同，因此可准确区分。总之，在阴离子模式下16种氨基酸都可以达到定量测定的要求。氨基酸标准溶液中提取的16种氨基酸的离子流图如图2所示。

图1 阴离子模式下16种氨基酸的质谱图Fig.1 Mass spectra of 16 amino acids detected under negative ionization mode

2.3.2 氨基酸标准品的定量分析

将2.1中配置的氨基酸系列标准溶液，按相应的质谱条件依次进样测定峰面积。以标准品溶液的浓度(μmol/L)为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，并求得16种氨基酸的线性回归方程及相关系数(见表2)。根据样品中16种氨基酸含量的差异，对各种氨基酸的线性范围进行了优化，从而得到最优 的回归方程和最佳测定浓度(见表2)。

图2 阴离子模式下氨基酸标准溶液中16种氨基酸的离子流图Fig.2 Ion flow of 16 amino acids detected under negative ionization mode

表2 16种氨基酸的线性回归方程，相关系数，RSD及回收率的测定结果Table 2 Linear regression equation，coefficient of correlation，RSD and recovery ratio of the 16 amino acids

2.4 精密度测定

精确配制浓度为50 μmol/L的16种氨基酸标准品混合溶液，按相同的质谱条件连续进样5次，计算峰面积，求得16种氨基酸的的相对标准偏差(RSD)在0.84% ～2.75%之间(见表2)。

2.5 回收率测定

准确配制25 mg/mL的细脚棒束孢样品溶液，加入适量的氨基酸标准溶液，进行加标回收试验，按与试验样品相同的方法测定峰面积，求得16种氨基酸的回收率为97.1%-102.8%(见表2)。

表3 7种虫生真菌样品中16种游离氨基酸的含量Table 3 Contents of 16 amino acids of the seven tested entomogenous fungi

2.6 7种虫生真菌样品中16种游离氨基酸含量的分析

按照前面优化的方法，对7种虫生真菌菌丝样品中16种游离氨基酸的含量进行了测定，结果见表3。从表中可以看出，同一菌株中各种氨基酸的含量相差较大，但所有菌株中含量最高的均为苯丙氨酸，其中，中国被毛孢的苯丙氨酸含量最高为2.173 mg/g;各菌株中胱氨酸的含量均很低，在最低线性浓度外;各菌株中脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和苯丙氨酸(Phe)含量基本在0.3 mg/g以上，较其他氨基酸含量明显较高，它们和苯丙氨酸一起可作为虫生真菌中游离氨基酸的特征指标。不同菌株间同种氨基酸含量也存在一定差异，对于含量最高的苯丙氨酸在不同菌株间的含量差异为0.718～2.173 mg/g;丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)在戴氏绿僵菌中的含量明显高于其他菌株。实验结果还表明，不同菌株间游离氨基酸总含量也存在较大差异，中国被毛孢中游离氨基酸总含量为7.537 mg/g，较蝉拟青霉(3.196 mg/g)的总含量高出1.36倍。

3 结论

本文采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱(LCTOF-MS)联用技术，在阴离子电离模式下，可快速地对16种氨基酸进行定性和定量测定。16种氨基酸的色谱特征和质谱离子特征明显，可准确定性。定量试验结果表明，16种氨基酸的线性范围广准确性高，在相关系数大于0.998时，线性范围都能达到4.0～125 μmol/L，最大可达2.0 ～500 μmol/L;在氨基酸浓度为50 μmol/L时，16种氨基酸的相对标准偏差在0.84% ～2.75%之间;回收试验结果显示，回收率为97.1%～102.8%。用液质联用法对中国被毛孢、蛹拟青霉、古尼拟青霉、蝉棒束孢、细脚棒束孢、戴氏绿僵菌和粉被玛利亚霉菌丝样品中16种游离氨基酸含量的测定结果显示，同一菌株中各种氨基酸的含量相差较大，但所有供菌株中含量最高的均为苯丙氨酸，它在不同供试菌株中的含量范围为0.718～2.173 mg/g，其中中国被毛孢的苯丙氨酸含量最高;供试菌株中含量较高的氨基酸还有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸，它们含量大部分都在0.3 mg/g以上，较其他氨基酸含量明显较高，可作为判定虫生真菌中游离氨基酸的特征指标。不同菌株间游离氨基酸总量也存在较大差异，中国被毛孢中游离氨基酸总含量为7.537 mg/g，较蝉拟青霉 (3.196 mg/g)的总含量高出1.36倍。总之，采用液质联用技术可以准确地对虫生真菌中16种游离氨基酸进行快速检测，其测定结果可为虫生真菌中游离氨基酸特征鉴定、资源利用和食用价值评价提供技术和理论参考。

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