应用香气化合物多维统计分析方法建立赤霞珠葡萄酒原产地模型

胡健宁1，范文来1，徐岩1，李记明1，2，于英2，姜文广2

1(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学酿酒科学与酶技术研究中心，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡，214122)2(张裕集团公司技术中心，山东 烟 台，264000)

葡萄酒中的香气成分十分复杂，不同的葡萄酒具有迥异的风格和特色。葡萄酒的香气成分主要受葡萄产区的气候、土壤、地质、品种等自然因素以及栽培管理措施、葡萄酒的酿造工艺等人为因素的影响［1］。因此只有在特定的区域内，才能酿造出品质优良、风格独特的葡萄酒，而标志这些地区的葡萄原料和葡萄酒的地理名称，即“地理标志”，也即我国“原产地域产品”［2］。Capron 和 Smeyers-Verbeke 等人［3］对欧洲4个国家400款葡萄酒运用统计学方法对原产国进行了鉴定;Saenz和Cedron等人［4］采用固相微萃取与气质联用技术(SPME-GC-MS)检测了244款西班牙不同地区红葡萄酒的风味物质并对原产地进行了分类鉴别。我国目前以香气化合物为依据对不同原产地域葡萄酒的研究较少。

葡萄酒挥发性香气成分的萃取方法最常用的有固相微萃取(SPME)［5］和液液微萃取(LLME)［6］等。近年来搅拌棒吸附萃取技术(SBSE)因具有高灵敏度、低检测限等优势发展迅速，已经广泛应用于葡萄酒风味的研究中［7-9］。现有报道中所用的搅拌棒外部包裹的吸附层大多为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，在本研究中采用了最新的极性搅拌棒，吸附层是由聚乙二醇改良的硅胶(EG-Silicone)组成，实验证明［10］，在威士忌、果汁和白葡萄酒中，新型的EG-Silicone搅拌棒对酚类、呋喃类、醇类和酸类等极性化合物的萃取能力明显高于PDMS搅拌棒，对于萜烯类和酯类等非极性化合物的萃取效果与PDMS搅拌棒基本相同，EG-Silicone搅拌棒整体萃取效果强于PDMS搅拌棒。

本研究以烟台、新疆、宁夏与北京四大产区的32款赤霞珠葡萄酒作为样本，采用搅拌棒吸附萃取(SBSE)以及液液微萃取技术(LLME)萃取葡萄酒中的香气成分，气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行检测定量，用多维统计方法分析定量数据并最终建立赤霞珠葡萄酒的原产地鉴定模型，为实现赤霞珠葡萄酒的原产地分类鉴别，实施葡萄酒原产地保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品和试剂

葡萄酒样品:由烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司提供，共32款赤霞珠葡萄酒，其中烟台产区10款，新疆产区12款，宁夏产区8款，北京产区2款。

试剂:NaCl、二氯甲烷、乙醚(上海国药集团，分析纯)，无水乙醇(上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯)，标准品(见表1，Sigma-Aldrich公司，色谱纯)。

1.2 主要仪器

气相色谱-质谱联用仪 Agilent GC 6890-5975 mass selective detector(MSD)、气相色谱 Agilent GC(美国安捷伦公司);Autosampler自动进样系统及极性Twister bar(德国GERSTEL公司)。

表1 不同产区赤霞珠葡萄酒中挥发性香气成分的方差分析结果及均值(μg/L)Table 1 ANOYA results for the mean values(μg/L)of volatile compounds for Cabernet Sauvignon wines from different regions

续表1

1.3 实验方法

1.3.1 搅拌棒吸附萃取-热脱附-气质联用(SBSETDU-GC-MS)

样品预处理:取10 mL葡萄酒样品，用10 mL煮沸过的超纯水稀释，加入5 μL内标(2-辛醇，终浓度为25 μg/L)，用6 g NaCl饱和，将极性搅拌棒放到样品中进行萃取，萃取条件为2.5 h，1 000 r/min。吸附萃取完成后，用超纯水冲洗搅拌棒，用无气味的吸水纸擦干，放入对应的自动进样口，待GC-MS检测。

热解吸系统(TDU)条件:不分流模式，初始温度35℃，500℃ /min 升到220℃，保留5 min。

冷进样系统(CIS)条件:液氮制冷，-60℃，升温程序为-60℃平衡0.2 min，10℃/min升到250℃保留3 min。

GC条件:色谱柱为FFAP极性柱(60 m×0.25 mm ×0.25 μm);升温程序为:50℃ 保持 2 min，以2℃/min速率升温至210℃，保持1 min，再以10℃/min速率升温至230℃并保持25 min。载气He，流速24 mL/min。

MS条件:EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，扫描范围35～350 amu。

1.3.2 液液微萃取-气质联用(LLME-GC-MS)

样品预处理:取5 mL葡萄酒样品，用10 mL煮沸过的超纯水稀释，加入12 μL内标(丙烯酸，终浓度为18.31 mg/L)，加4.5 g NaCl饱和，用0.5 mL重蒸过的乙醚∶二氯甲烷(体积比1∶1)萃取，萃取完成后，将上层有机相转入离心管中，10 000 r/min，2 min，取上清液，进GC-MS分析。

GC条件:色谱柱为FFAP极性柱(60 m×0.25 mm ×0.25 μm);直接进样，进样量为 1 μL，不分流进样;升温程序为:50℃保持1 min，以10℃/min升温至230℃，保持 20 min。

MS条件:同上。

1.3.3 化合物定性与定量

挥发性化合物的定性通过与NIST 05质谱库(Agilent Technologies Inc.)中标准图谱以及标准品的保留指数(RI)比对定性，没有标准品的化合物采用文献中报道的保留指数(RIL)进行比对定性。

定量时每种待测物质分别对应于内标作标准曲线，经过GC-MS检测后利用待测物质和内标的相对峰面积比代入相应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。每种待测物质的峰面积采用选择离子(SIM)积分确定。

1.3.4 数据处理

采用多维统计方法，用SPSS20.0统计分析软件对所得的定量数据进行方差分析(ANOVA)，主成分分析(PCA)和判别分析(DA)，对赤霞珠葡萄酒的原产地进行鉴别。

2 结果与讨论

采用SBSE-TDU-GC-MS和LLME-GC-MS技术在不同产区赤霞珠葡萄酒中共定量59种香气成分，其中包括14种醇类、15种酯类、5种萜烯类、1种降异戊二烯类、7种酚类、9种酸类、7种芳香族类及1种内酯类化合物。在不同产区的葡萄酒中鉴定出的香气成分种类基本相同，但是在含量上存在较大差异，应用多维统计的方法对定量的59种化合物进行分析，建立不同产区赤霞珠葡萄酒的原产地鉴定模型。

2.1 不同产区赤霞珠葡萄酒中挥发性香气成分的方差分析(ANOVA)

方差分析的目的是通过数据分析找出对该事物有显著影响的因素，各因素之间的交互作用，以及显著影响因素的最佳水平等。

对定量的59种化合物进行方差分析，总共有23种化合物的 F 值大于 F 临界值(F3，31，0.05=2.91)，结果见表1。说明这23种香气成分对区分不同产区赤霞珠葡萄酒的风味有显著性影响，其中包括7种醇类、6种酯类、4种萜烯类、1种降类异戊二烯、2种酚类和3种芳香族类。

由于气候、土壤、地质等地域因素的影响，从而使不同产区的葡萄在香气构成上产生了差异［11］，葡萄酒中来源于葡萄原料的香气成分主要有萜烯类、降异戊二烯类和硫醇类等化合物，属于品种香［12］。由表1 可知，4-萜品醇、α-萜品醇、β-香茅醇、香叶醇、萘和3-甲硫基-1-丙醇的F值均大于临界值，因此对不同产区酒样的香气特征有显著影响。其中4-萜品醇的F值达到最高为18.96，影响力最为显著，此化合物在葡萄酒中呈现出花香［13］。烟台产区酒样中4-萜品醇、α-萜品醇含量远高于其他3个产区，通过这两个香气成分可以大体区别烟台产区的酒样;而海拔较高的新疆和宁夏产区酒样中香叶醇和3-甲硫基-1-丙醇的均值高于其他两个产区，3-甲硫基-1-丙醇具有强烈的烤土豆香，在葡萄酒中一般认为是一种异味，其合成主要与含硫氨基酸的代谢有关［14］。

在葡萄酒发酵过程中产生的香气成分，如醇类、酯类、酸类和芳香族类化合物，属于发酵香［15］。据表1，醇类物质中有 2-甲基丙醇、1-戊醇、1-己醇、顺-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇和1-壬醇对不同产区葡萄酒的风味有显著影响，其中1-壬醇的F值大于13，北京产区酒样中1-壬醇的含量最低，新疆与宁夏产区差别不大。酯类化合物中乙酸己酯、乳酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯和香草酸甲酯的F值大于2.91，乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯是葡萄酒中含量最高的酯类物质，但是由于其较高的阈值，对葡萄酒风味的贡献小于其他酯类［16］。芳香族类化合物中2-苯乙醇、乙酸2-苯乙酯和苯甲酸对葡萄酒的风味有显著的贡献，其中2-苯乙醇与乙酸2-苯乙酯的F值高达13.28，11.41。2-苯乙醇主要来源于酵母的代谢过程，具有玫瑰与蜂蜜的香气特征，是葡萄酒中普遍存在的含量较高的香气成分［17］，2-苯乙醇在不同产区葡萄酒中的含量达到17～34mg/L，新疆产区的均值最高;乙酸2-苯乙酯呈现蜂蜜香气，是葡萄酒中重要的香气贡献者［18］，北京产区的葡萄酒中含量远远高于其他3个产区，可以作为区分的依据;而苯甲酸的F值只有2.93，各产区的差别不明显。

挥发性酚类化合物在葡萄酒中一般是来源于葡萄原料或是葡萄酒成熟过程中所用的橡木［19］。张裕公司提供的酒样没有经过橡木桶的贮存，所以在酒样中检测到的酚类物质是来源于葡萄原料。由表1可知，4-乙基苯酚和2，6-二甲氧基苯酚的 F值大于其临界值，分别为3.21与4.38，这些酚类物质具有药物、皮革和烟熏等嗅觉特征［20］，新疆产区的葡萄酒中4-乙基苯酚含量最低，而2，6-二甲氧基苯酚均值较高。

2.2 不同产区赤霞珠葡萄酒的主成分分析(PCA)

主成分分析不能看作是研究的结果，而应该在主成分分析的基础上继续采用其他多元统计方法来解决实际问题。在评价某个原始变量对整个信息的重要性时，主要是根据主成分中此原始变量载荷的大小，载荷越大说明该变量对主成分的贡献越大。

以59种挥发性香气物质的定量数据为参数，对不同产区葡萄酒样品进行主成分分析，采用了方差最大正交旋转法处理变量数据，旋转在20次迭代后收敛。前九个主成分的累积方差贡献率为82.45%，其中主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分别解释了26.82%和14.05%的变量信息。在PC1中，4-甲基苯酚和α-萜品醇的载荷最高都在0.9以上，苯甲醇、里那醇、4-乙基苯酚、丁子香酚、4-萜品醇和乙酸的载荷都在0.7以上，这些成分对PC1的贡献较大，在这8种香气成分中有6种属于萜烯类和挥发性酚类物质，主要来源于葡萄原料，由此看出PC1主要反应了葡萄原料对葡萄酒贡献的香气信息。在PC2中，癸酸和辛酸乙酯的载荷较高在0.8以上，1-壬醇、2-壬醇、3-辛醇、辛酸甲酯和棕榈酸乙酯的载荷也都在0.65以上，这些化合物均是葡萄酒发酵过程的产物，PC2主要表征了醇类、酯类、酸类和芳香族类等在发酵过程产生的香气化合物的信息。PC1和PC2这两个主成分代表了来源于葡萄原料与发酵过程中香气成分的绝大部分信息，因此提取PC1和PC2两个主成分中的重要化合物进行进一步的分析是合理的。

2.3 不同产区赤霞珠葡萄酒的判别分析(DA)

判别分析是在分类确定的条件下，根据某一研究对象的各种特征值判别其类型归属问题的一种多变量统计分析方法。按照一定的判别准则，建立一个或多个判别函数，用研究对象的大量资料确定判别函数中的待定系数，并计算判别指标，据此即可确定某一样本属于何类。

采用逐步判别分析法建立烟台、新疆、宁夏和北京四大产区赤霞珠葡萄酒的原产地鉴定模型。为了更简单快速的对酒样分类，需要减少自变量的个数，那么需要找到能代表不同产区葡萄酒特征的自变量，这些自变量可以根据方差分析与主成分分析的结果进行提取选择。

依据方差分析的结果，首先选择具有较大F值的化合物，其中包括4-萜品醇、1-壬醇、2-苯乙醇和乙酸2-苯乙酯;而3-甲硫基-1-丙醇是唯一的硫醇类化合物，苯甲酸是所有定量酸类化合物中唯一F值大于临界值的化合物，因此通过方差分析的结果共选定6种香气成分。主成分分析得到的PC1与PC2，选择在这两个主成分中有最高载荷的物质，PC1中有4-甲基苯酚和α-萜品醇，PC2中有癸酸和辛酸乙酯，首先确定这4种物质。通过两种分析的结果确定了10种香气化合物。在此10种物质的基础上，结合方差分析与主成分分析筛选出的剩余香气成分，通过分析探索，增加3-辛醇、2-壬醇和棕榈酸乙酯作为自变量进行判别分析，不同产区的葡萄酒的鉴别模型更加完善。综上，最终确定选用13种香气成分(4-萜品醇、1-壬醇、2-苯乙醇、乙酸 2-苯乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、苯甲酸、4-甲基苯酚、α-萜品醇、癸酸、辛酸乙酯、3-辛醇、2-壬醇、棕榈酸乙酯)作为变量进行判别分析。

采用逐步判别分析法，以Wilks’Lambda(Wilks’λ法)作为变量选择的标准，共得到三个典型判别函数，前两个函数的累积方差贡献率到达了93.5%，其典型标准化的判别函数系数见表2。

图1为不同产区赤霞珠葡萄酒的判别分析结果，可以看出烟台、新疆、宁夏与北京4个产区的葡萄酒都可以很好的区分，各酒样都比较紧密的围绕在质心周围，不同产区间的酒样空间距离较大，可以很准确进行的区分鉴定。当得到某一未知葡萄酒的相关数据，可以根据表2给出的系数以及图1各质心的位置对未知酒样进行判定，从而得知其归属于哪一产区。

表2 判别分析标准化典型判别函数系数Table 2 Standard canonical discriminant function coefficients of DA

图1 不同产区赤霞珠葡萄酒的判别分析结果Fig.1 Dsicriminant functions of Caernet Sauvignon wines from different regions

对于所建立的赤霞珠葡萄酒原产地鉴定模型的准确性和稳定性可以通过交叉验证法进行验证，结果见表3，该模型对32款葡萄酒全部正确分类，同时交叉验证的结果显示对未知样品归类的准确率到达100%，充分肯定了此模型对赤霞珠葡萄酒原产地鉴别的能力。

3 结论

定量了四大产区32款赤霞珠葡萄酒中59种化合物，通过方差分析与主成分分析选出了13种代表性化合物作为葡萄酒产地判别的自变量(4-萜品醇、1-壬醇、2-苯乙醇、乙酸 2-苯乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、苯甲酸、4-甲基苯酚、α-萜品醇、癸酸、辛酸乙酯、3-辛醇、2-壬醇、棕榈酸乙酯)，用这13种物质进行判别分析并建立了赤霞珠葡萄酒的原产地鉴定模型。该模型对32款不同产区的葡萄酒进行了正确的分类，同时交叉验证的结果显示对未知样品归类的准确率到达100%，这对国产赤霞珠葡萄酒的产区鉴定具有重要的意义与作用。

表3 判别分析分类结果Table 3 Classifi cation results of DA

b)仅对分析中的案例进行交叉验证。在交叉验证中，每个案例都是按照从该案例以外的所有其他案例派生的函数来分类的;

c)交叉验证分组案例中100.0%的样品进行了正确分类。

［1］ Cynkar W，Dambergs R，Smith P，et al.Classification of Tempranillo wines according to geographic origin:Combination of mass spectrometry based electronic nose and chemometrics［J］.Analytica Chimica Acta，2010，660(1-2):227-231.

［2］ 李华，李佳，王华.昌黎原产地域赤霞珠干红葡萄酒香气成分研究［J］.西北农林科技大学学报，2007，35(6):94-98.

［3］ Capron X，Smeyers-Verbeke J，Massart D L.Multivariate determination of the geographical origin of wines from four different countries［J］.Food Chemistry，2007，101(4):1 585-1 597.

［4］ Saenz C，Cedron T，Cabredo S.Classification of wines from five Spanish origin denominations by aromatic compound analysis［J］.Journal of Aoac International，2010，93(6):1 916-1 922.

［5］ 沈海月，范文来，徐岩，等.应用顶空固相微萃取分析四种红葡萄酒挥发性成分［J］.酿酒，2008(2):71-74.

［6］ 尹建邦，范文来，徐岩.蛇龙珠葡萄酒中挥发性有机酸风味的研究［J］.食品工业科技，2009，20(12):142-144.

［7］ Caven-Quantrill D J，Buglass A J.Comparison of volatile constituents extracted from model grape juice and model wine by stir bar sorptive extraction-gas chromatographymass spectrometry ［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(7):875-881.

［8］ Delgado R，Duran E，Castro R，et al.Development of a stir bar sorptive extraction method coupled to gas chromatography-mass spectrometry for the analysis of volatile compounds in Sherry brandy ［J］.Analytica Chimica Acta，2010，672(1-2):130-136.

［9］ Fang Y，Qian M C.Quantification of selected aroma-active compounds in pinot noir wines from different grape maturities ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(22):8 567-8 573.

［10］ Nie Y，Kleine-Benne E.Using three types of twister phases for stir bar sorptive extraction of whisky，wine and fruit juice.Gerstel Application Note-3/2011.

［11］ Marti M P，Busto O，Guasch J.Application of a headspace mass spectrometry system to the differentiation and classification of wines according to their origin，variety and ageing［J］.Journal of Chromatography A，2004，1057(1-2):211-217.

［12］ Zalacain A，Marin J，Alonso G L，et al.Analysis of wine primary aroma compounds by stir bar sorptive extraction［J］.Talanta，2007，71(4):1 610-1 615.

［13］ Camara J S，Alves M A，Marques J C.Classification of Boal，Malvazia，Sercial and Verdelho wines based on terpenoid patterns［J］.Food Chemistry，2007，101(2):475-484.

［14］ Swiegers J H，Pretorius I S.Yeast modulation of wine flavor［J］.Advances in Applied Microbiology，2005，57:131-175.

［15］ Louw L，Tredoux A G J，Van Rensburg P，et al.Fermentation-derived aroma compounds in varietal young wines from South Africa［J］.South African Journal of E-nology and Viticulture，2010，31(2):213-225.

［16］ 尹建邦.烟台产区蛇龙珠葡萄酒中挥发性香气成分的研究.［D］.无锡:江南大学，2009.

［17］ Fang Y，Qian M.Aroma compounds in Oregon Pinot Noir wine determined by aroma extract dilution analysis(AEDA)［J］.Flavour and Fragrance Journal，2005，20(1):22-29.

［18］ Hayasaka Y，MacNamara K，Baldock G A，et al.Appli-cation of stir bar sorptive extraction for wine analysis［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2003，375(7):948-955.

［19］ Rapp A.Volatile flavour of wine:correlation between instrumental analysis and sensory perception ［J］.Food/Nahrung，1998，42(06):351-363.

［20］ 范文来，徐岩，李记明.应用GC-O和GC-MS研究蛇龙珠葡萄酒游离态挥发性香气成分［J］.食品与发酵工业，2012，37(11):183-188.