丁香油放置过程中丁香酚含量变化及抗菌作用的研究

李巧如 归巧娣 陕西省人民医院（西安71068）

丁香油是桃金娘科植物丁香Syzygium aromaticum Merr.Perry（Eugeia caryophLLata Thumb.）的干燥花蕾，经水蒸气蒸馏得到的挥发油。其中所含化学成分以丁香酚为主占（57～85%）、石竹烯（14.408%）、丁香酚乙酸酯（17.930%）［1］。丁香油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺痢疾杆菌、铜绿假单孢杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草杆菌、产酸克雷伯菌、表皮葡萄球菌及部分深部真菌皆有明显的抑制和杀灭作用［2－4］。但丁香油性质不稳定，随着放置时间，颜色变黄，其中丁香酚含量变化如何以及其抗菌作用有何变化，未见文献报道，本文就丁香油于温度25±2℃，相对湿度60%±10%放置0、1、2、3、6、12个月，及温度40±2℃，相对湿度75%±5%放置1、2、3个月后各丁香酚含量的变化及其对金黄色葡萄球菌等7种致病菌的抗菌强度（MIC）变化进行研究，结果报道如下。

1 仪器与试药 1.1 仪器 岛津10A－vp高效液相色谱仪：包括SPD－M10Avp二极管阵列检测器、Shimadzu CLASS VP色谱工作站。Inertsil ODS C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）（日本株式会社）。电子天平（日本株式会社）。恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂），真空干燥箱（天津市津北真空仪器厂），100μL微量加样器（上海求精生化仪器厂），96孔培养板。

1.2 试药 丁香油自制。丁香酚对照品（批号：725－200008）购于中国药品生物制品检定所。水为双重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3 菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌 （ATCC25922）、铜绿假单孢杆菌（ATCC27853）为标准菌株，购于卫生部临床检验中心。表皮葡萄球菌（201103）、鲍蔓不动杆菌（201106），阴沟杆菌（201108），肺炎克雷伯菌（201101）由陕西省人民医院检验科从临床标本培养分离得到。

1.4 培养基 沙氏培养基，批号20110406；M－H琼脂培养基，批号20110108；M－H 肉汤培养基，批号20110229，均系杭州微生物试剂有限公司产品，加0.3%的琼脂制成半固体培养基。

2 方法与结果 取丁香油置4个磨口棕色瓶中，每瓶10mL，每2个分别置于温度25℃±2℃，相对湿度60%±10%及温度40℃±2℃，相对湿度75%±5%下保存，用高效液相法测定放置0、1、2、3、6、12个月后各丁香酚的含量；用微量琼脂稀释法测定其对金黄色葡萄球菌等7种致病菌的抗菌强度（MIC）。

2.1 丁香酚的含量测定 2.1.1 色谱条件：Inertsil ODS C18色谱柱；流动相：A 为乙腈，B为0.1%磷酸溶液，进行梯度洗脱，0～30min，A：45→70%；30～35min，A：70→95%；35～50min，A：95%；50～55min，A：95→45% 。检测波长230nm；柱温30℃；流速1mL·min－1。

2.1.2 对照品溶液的制备：精密吸取丁香酚对照品5.01mg至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再从中精密吸取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，终浓度为20.04μg／mL。

2.1.3 供试品溶液的制备：精密吸取丁香油5.00mg至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再从中精密吸取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 线性关系考察：分别精密吸取丁香酚对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定。以丁香酚检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程Y＝7E＋09X＋613166，r＝0.9991结果表明，丁香酚在0.2004～1.002μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验在上述色谱条件下精密吸取浓度为20.04μg／mL的丁香酚对照品溶液10μL，注入色谱仪，连续测定6次。结果RSD为0.80%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验：取同一供试品溶液适量，分别于0，1，2，4，6，8h按上述色谱条件进样测定。结果RSD为1.76%，表明供试品溶液在10h内稳定。

2.1.7 重复性试验：取同一批样品5份，分别按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果丁香酚RSD 为1.61%，表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验：精密吸取已知含量的样品9份，分别精密加入一定量丁香酚对照品溶液混合均匀，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。

表1 加样回收率实验结果

2.1.9 丁香油放置不同时间丁香酚含量测定：取于温度25±2℃，及40±2℃放置0、1、2、3、6、12个月的丁香油测定其中丁香酚含量，方法同前，见表2。

表2 丁香油放置不同时间丁香酚含量测定结果（n＝2）

实验结果发现，丁香油中的丁香酚在两种条件下保存，丁香酚均相对比较稳定。

2.2 丁香油放置不同时间抗菌试验 2.2.1 药物配制：精密吸取丁香油1.0mL，置10mL试管中，加入无菌0.1%琼脂溶液6mL混匀。再精密吸取2mL用无菌生理盐水溶液依次作2、4、8、32、64、128、256、512倍稀释，即得不同浓度的丁香油溶液。

2.2.2 菌液的制备：用无菌枪头挑取数个新鲜的金黄色葡萄球菌菌落于2mL营养肉汤管中，制成0.5麦氏比浊度的菌悬液，置37℃温箱孵育2～3h，取50μL菌悬液加入10mL微量半固体培养基［2］中混匀，备用。其它菌株操作相同。

2.2.3 抗菌试验：用微量琼脂稀释法，取96孔培养板每孔分别加入经倍比稀释的丁香油溶液50μL再分别加入制备好的各菌液50μL，轻轻混匀，置37℃培养箱，培养24h，观察结果。每个样品浓度重复实验1次。（见表3）

表3 丁香挥发油放置不同时间的体外抗菌试验结果（稀释倍数）

3 讨 论 丁香酚含量测定有采用气相色谱法［5］和液相色谱法［6］等方法，其中液相色谱法应用较普遍，本研究采用高效液相色谱法测定丁香油中丁香酚含量。通过对丁香酚标准品甲醇溶液在200～400nm进行扫描，发现其在230nm 有最大吸收，故选择230nm 为检测波长。对色谱条件中流动相系统进行了考察，发现用乙腈－0.1%磷酸溶液系统分离峰最好。丁香油中除丁香酚外，石竹烯和丁香酚乙酸酯含量也较大，为了更好地考察丁香油的稳定性，本研究最终确定用乙腈－0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，同时测定了石竹烯和丁香酚乙酸酯的峰面积积分值。观察结果显示，丁香油于温度25±2℃放置12个月，及40±2℃放置3个月其中丁香酚含量变化不显著，且丁香油中丁香酚比丁香酚标准品要稳定得多，是何原因有待深入研究（丁香烯峰面积变化不显著，丁香酚乙酸酯峰面积在显著减小），而丁香油的抗菌作用随放置时间无明显变化。

［1］ 陈邱琴，崔兆杰，韦栋梁，等.丁香挥发油化学成分的研究［J］.药物分析杂志，2003，23（6）：443－446.

［2］ 李巧如，刘宗智，任健康，等.丁香提取物抗菌机理的探讨［J］.西北药学杂志，2001，16（6）：261－262.

［3］ 赵晨曦，梁逸曾，李晓宁.丁香挥发油化学成分与抗菌活性研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18（3）：381－385.

［4］ 吕世民，陈杖榴，陈建新.丁香酚体外抗菌作用的研究［J］.食品科学，2008，29（9）：122－124.

［5］ 王海英.气相色谱法测定丁香油中丁香酚含量［J］.哈尔滨医药，2009（29）：20－21.

［6］ 余小平.高效液相色谱法测定丁香中丁香酚的含量［J］.药物分析杂志，2008，28（6）：975－977