风湿骨痹口服液质量标准研究＊

辛玲歌 张 旋 张媛媛 陕西中医学院第二附属医院（咸阳712000）

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，是以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为病理特征的疾病，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。据调查，目前骨性关节炎的发病率逐年增高，却没有较理想的治疗手段，因此探寻一种有效、简便、安全、经济的膝关节骨性关节炎治疗方法是必要的。“风湿骨痹口服液”是根据中医辨证论治理论和长期实践积累，经反复临床验证总结出的具有滋补肝肾、活血祛瘀、温经止痛的纯中药复方制剂。它由杜仲、淫羊藿、黄芪、熟地黄、续断、菟丝子、威灵仙、牛膝、丹参等16味中药材组成。通过临床验证，疗效确切。为了控制该制剂的质量，笔者采用薄层色谱法（TLC）对处方中的黄芪、熟地黄、甘草进行薄层色谱鉴别，采用高效液相色谱法测定“风湿骨痹口服液”中原儿茶醛的含量并进行方法学考察，为临床应用提供科学依据，现将结果报道如下。

1 材 料 1.1 药品 风湿骨痹口服液，陕西中医学院第二附属医院制剂室生产（批号：20110505；20110507；20110509）黄芪甲苷对照品（编号：110781－200613；供含测用，由中国药品生物制品鉴定所提供）；熟地黄对照药材（编号：121196－200804，由中国药品生物制品鉴定所提供）；甘草对照药材（编号：0904－200108，由中国药品生物制品鉴定所提供）；原儿茶醛对照品（编号：110810－201007，由中国药品生物制品检定所提供），甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 日本日立高效液相色谱仪、L－2455二极管阵列检测器、L－2130四元泵、L－2200自动进样器、L－2300柱温箱、L－2000色谱数据工作站；日本岛津电子天平AUW120D。

2 方 法 2.1 薄层色谱鉴别 2.1.1 黄芪［1，2］取本品20mL，用水饱和的正丁醇提取三次，每次5mL，合并正丁醇液，以1%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次5mL，弃去洗液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加稀乙醇1mL 使溶解，加在中性氧化铝柱（100～120目，2g，内径为1～1.5cm）上，用40%乙醇50mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水1mL 使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.2～1.5cm，柱高为12cm），依次用水20mL、40%乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）10℃以下放置后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加热至斑点显色清晰，置日光和紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外光下显相同颜色的荧光斑点。结果见图1。

图1 黄芪TLC图（365nm）

2.1.2 熟地黄［1，3］取本品10mL，加水20mL，摇匀，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取熟地黄对照药材4g，加水50mL，煎煮30min，滤过，滤液与供试品同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取以上两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图2

图2 熟地黄TLC图

2.1.3 甘草［1，4］取本品20mL，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，弃去乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20mL，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，加水50mL煎煮30min，滤过，滤液与供试品同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB试验吸取上述两种溶液各5μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15：1：1：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图3。

图3 甘草TLC图

2.2 含量测定［5］2.2.1 色谱条件 kromasil C18色谱柱（4.6mm×200mm，5μm）；甲醇－水－冰醋酸（10：87：1）为流动相；流速1.0mL·min－1；柱温为室温；检测波长278nm。进样量10μL；在上述的色谱条件下原儿茶醛完全达到基线分离。与邻峰分离大于1.5，按原儿茶醛峰计算理论板数均在3000以上。

2.2.2 检测波长的选择 根据原儿茶醛的紫外线吸引图谱，原儿茶醛的最大吸引波长为278nm，故我们选用278nm 作为检测波长。通过研究，在此波长处测定杂峰干扰小。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶醛对照品适量，加甲醇制成每1mL 含0.0213mg的溶液，即得。

2.2.4 供试品溶液的制备 精密量20110505批次风湿骨痹口服液20mL，加水20mL，摇匀，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，用水洗涤2次，每次15mL，弃去水洗液，乙酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，转移至50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 阴性干扰试验 按处方中各味药比例称取适量，按工艺及制法制成缺丹参的空白样品，同供试品溶液制备方法制得空白对照溶液，进样。结果空白对照溶液在与对照品溶液色谱保留时间相应的位置上无其它色谱峰出现，说明其它成份对原儿茶醛无干扰。结果见图4

图4 风湿骨痹口服液高效液相色谱图

2.2.6 线性关系的考察 精密吸取对照品（浓度0.0213mg／mL）2，5，7.5，10，12.5，15μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件注入色谱仪，测定峰面积。以原儿茶醛峰面积（Y）对进样浓度（X）进行回归，得回归方程：Y＝1998.5X－2350.8，R2＝0.9999，线性范围42.6μg～319.5μg。

2.2.7 稳定性试验 取同一批供试品（产品批号：20110505）溶液，分别在0、1、4、8、12h注入液相色谱仪测定一次峰面积，结果RSD%＝1.67，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.2.8 精密度试验 取对照品溶液（20.3μg·mL－1）溶液各10μL，连续5次注入液相色谱仪测定峰面积，结果RSD＝0.32%，说明仪器的精密度较好。

2.2.9 重现性试验 同一批供试品（20110505）6份按正文含量测定方法测定，RSD＝0.59%，说明方法的重现性好。

2.2.10 回收率试验 精密称取原儿茶醛对照品适量，加入已知含量的样品（约为测定方法中样品的十分之一）中，按正文含量测定方法测定，计算回收率，结果见表1。说明本方法回收率较好，方法可行。

表1 回收率试验结果

2.2.11 样品测定 取3批样品，分别制备样品溶液，进行测定，以外标法计算。测定结果见表2。

表2 三批样品测定结果

3 讨 论 风湿骨痹口服液是由杜仲、淫羊藿、黄芪、熟地黄、续断、菟丝子、威灵仙、牛膝、丹参等十六味中药制成的口服制剂。具有滋补肝肾、活血祛瘀、温经止痛之功效。用于痹症膝骨性关节炎等证的治疗。由于本制剂是复方制剂，药物多，有效成分复杂，质量标准控制指标一直是质控中的难点，使其临床应用受到很大限制，为此我们需要对其进行质量标准的研究。在研究过程中，我们对风湿骨痹中十六味药物进行筛选，用薄层色谱法对黄芪、熟地黄、甘草进行定性鉴别，结果供试品与对照品相应的位置上有相同的斑点，阴性对照品无干扰，方法具有专一性。采用高效液相色谱法测定口服液中原儿茶醛的含量，分离度好、精密度高、重现性好、阴性无干扰。因此对通过“风湿骨痹口服液”中有效物质定性鉴别和含量测定及方法学考察的研究，说明此方法结果可靠，重现性好，可用于“风湿骨痹口服液”质量的控制。

［1］ 国家药典委员会中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅥB.

［2］ 田继义，罗红锁.益气养血口服液的薄层鉴别研究［J］.陕西中医，2009，30（10）：1399－1400.

［3］ 王孟良，赵佳丽.宁神补心片质量标准研究［J］.药物鉴定，2011，20（16）：42－44.

［4］ 江 文，王 斌.抗心衰口服液的质量标准研究［J］.江苏中医药，2011，43（11）：70－71.

［5］ 陈艳霞.HPLC法测定丹参通脉口服液中原儿茶醛的含量［J］.中国药师，2009，12（9）：1268－1270.