天然黄酮芦丁的化学改性及抑菌作用

郭艳华，许国权，李艾华，张玉敏

（江汉大学 a.化学与环境工程学院； b.生命科学学院，湖北 武汉 430056）

芦丁（Rutin）属黄酮类化合物，为天然产物的有效成分，毒性低，具有广泛的生物活性，临床上主要用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜、急性出血性肾炎、慢性支气管炎、镇痛、抗辐射和抗疲劳，且有抗氧化和抗菌作用等［1］。近年来，国内外文献还报道芦丁具有抗癌作用［2］。芦丁分子中同时含有4－羰基5－羟基和邻二酚羟基，强配位氧原子与合适的空间构型可与多种金属离子生成配位数不同的配合物，将这种具有特定生理活性的芦丁与金属离子形成配合物，既增强了配体的生物活性又降低了其毒性。研究表明，有些芦丁过渡金属配合物具有明显的生物活性，有些药理作用显著，有些已证明具有抗菌性和抗肿瘤活性。因此，芦丁的改性产物成为国内外近些年来研究的热点，特别是对于稀土芦丁配合物的生物活性研究较多［3－4］，而对第一过渡系金属芦丁配合物的生物活性极少报道，且一些文献的报道都是在不同的条件下研究的个别改性产物，无系统性研究，且研究的结果也有较大差别［5－8］。至今，国内外对芦丁与第一过渡系生命元素形成的配合物在同等条件下的抗菌活性的比较研究未见报道。本课题比较研究了第一过渡系生命元素对芦丁改性产物配合物的抑菌活性，对开拓芦丁改性配合物在食品、药品等领域的应用具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁，氯化钠，乙酸铬，乙酸锰，乙酸铁，乙酸钴，乙酸镍，乙酸铜，乙酸锌，无水乙醇，甲醇，二甲基亚砜（DMSO），三氯乙酸，乙酸乙酯，三羟甲基氨基甲烷（Tris），均属分析纯。

牛肉膏，蛋白胨，琼脂均属生化试剂。

供试菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草杆菌（江汉大学生命科学学院实验室提供）。

1.2 仪器与设备

生化培养箱（国华仪器），无菌工作台（苏净集团安泰公司制造），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。721 分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），UV－2401 紫外可见分光光度计（日本岛津），RE－S2 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），DF110 型电子分析天平（中国轻工业机械总公司常孰衡器公司），红外光谱仪－Tensor 27（德国bruker 公司），电热真空干燥箱（海申光仪器仪表有限公司），HH－2 数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），JJ－1 型定时电动搅拌器（江苏金坛中大仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的制备 在探讨出来的最佳合成条件（温度，pH，反应时间）下制备第一过渡系生命元素的芦丁配合物。称取一定量的芦丁，溶于一定量体积的无水乙醇，电磁搅拌；待大部分配体溶解后，滴加氨水和乙醇的溶液，调节至合适的pH；边搅拌边加入溶有一定量的过渡金属盐的无水乙醇溶液，并在室温下搅拌一定时间，溶液中有沉淀生成，停止反应，离心分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤沉淀，真空干燥后得到有色固体样品，经结构表征得到①Ru－Cr；②Ru－Mn；③Ru－Fe；④Ru－Co；⑤Ru－Ni；⑥Ru－Cu；⑦Ru－Zn 等改性配合物（配合物合成的最佳条件探讨及其表征本课题组将另行报道）。测定改性产物配合物与芦丁的溶解性。

1.3.2 芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的抑菌作用比较 （1）培养皿的制备［9］。称取5. 0 gNaCl，10. 0 g 蛋白胨，3. 0 g 牛肉膏于1 000 mL 烧杯中，加入800 mL 的蒸馏水，加热搅拌使其溶解，待充分溶解后，加入15 g 琼脂粉，加入200 mL 蒸馏水，用NaOH 溶液调节pH 至7. 5，煮沸两次后，趁热转移至洗净的培养皿中，待培养皿中液体冷却凝固后，将培养皿置于压力蒸汽灭菌器中灭菌20 min。灭菌完毕后，置于培养箱中培养，若无菌生长，即可放入冰箱待用。

（2）抑菌实验方法。以DMSO 为溶剂溶解一定量的配合物，用无菌水稀释成10 mg/mL 浓度的溶液，采用同样的方法制成相同浓度的芦丁和金属醋酸盐溶液，供抑菌实验。用滤纸片法测定芦丁配合物、芦丁及过渡金属醋酸盐在相同浓度下的抑菌效果，以抑菌圈直径作为评价标准［9］。打开无菌工作台的紫外灭菌灯灭菌20 min，然后用无菌水配置菌液，用无菌吸管吸取1 mL 的无菌水，用无菌铁圈蘸取不同菌种，在无菌水中搅拌，重复之前的操作一次。吸取200 μL 刚配好的大肠埃希菌菌液加到制备好的培养皿平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀，将已涂布好的平板底皿做上记号，每等份内标明一种溶液的编号，用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片（D7 mm）分别浸入装有不同物质配制的不同浓度溶液于小瓶中，每一区域贴3 片，再将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放入恒温箱中培养，37 ℃培养24 h 后，用游标卡尺测定其抑菌圈直径。分别比较不同样品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草杆菌的抑菌活性。实验结果见表2。

1.3.3 芦丁第一过渡系生命元素改性产物浓度变化对抑菌作用的影响 用DMSO 和无菌水为溶剂配制浓度为30、10、1、0.5 mg/mL 配合物的溶液，按1.3.2 的方法测定芦丁第一过渡系生命元素改性产物浓度变化对抑菌作用的影响，测定①～⑧样品（见2.2），供试菌种选用样品对其抑菌作用相对较强的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。

1.3.4 芦丁第一过渡系生命元素改性产物抑菌活性的稳定性研究 取浓度为10 mg/mL 配合物的溶液，进行如下几种方法处理：分别置于不同的温度（20、40、60、80、100、120 ℃）条件下；将样品调制成不同的pH（2、4、6、8、10）的溶液。根据1.3.2 的方法研究芦丁第一过渡系生命元素改性产物的抑菌作用，以抑菌圈直径为评价指标，测定芦丁第一过渡系生命元素改性产物在不同条件下的稳定性［10］，供试菌种选用样品对其抑菌作用相对更强的金黄色葡萄球菌。

2 结果与讨论

2.1 芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的溶解性测定结果

第一过渡系生命元素对芦丁化学改性后配合物的溶解性测定结果见表1。

表1 配合物和芦丁溶解性测定结果

由表1 可知，配合物和芦丁能溶于部分有机溶剂，但是溶解度较低。配合物和芦丁在DMSO中的溶解效果明显好于实验中的其他溶剂，而且比较发现芦丁在生成配合物后水溶性明显增强，这预示芦丁的改性产物提高了其生物利用度。

2.2 芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的抑菌效果比较

按1.3.1 和1.3.2 的方法测定，并将样品编号为：①Ru－Cr；②Ru－Mn；③Ru－Fe；④Ru－Co；⑤Ru－Ni；⑥Ru－Cu；⑦Ru－Zn；⑧Ru；⑨Cu（Ac）2；⑩R（Ac）3（R=Cr，Fe）；11 Y（Ac）2（Y= Mn，Co，Ni，Zn）。供试样品浓度均为10 mg/mL，圆滤纸片的直径为6 mm，在37 ℃经24 h 培养后，用游标卡尺测定其抑菌圈直径，数据列于表2。

表2 不同芦丁配合物与芦丁的抑菌效果比较

根据抑菌圈大小可以初步确定物质的抑菌能力大小，抑菌圈直径越大表明抑菌活性越高［11］。

由表2 数据分析可知：芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的抑菌效果强于芦丁和金属醋酸盐，金属醋酸盐中除了醋酸铜在较高浓度下有很弱的抑菌活性外，其他几种金属醋酸盐在测定的几种浓度下没有发现其抑菌作用，而同样在此很低的浓度下，所得到芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物仍然有明显的抑菌作用；编号①～⑦这7 种配合物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌性能，但系列改性配合物对大肠埃希菌的抑菌效果差别不大，对枯草杆菌的抑菌效果只达到中等敏感程度，对啤酒酵母的抑菌作用与芦丁接近，说明本文所报道的这7 种配合物对不同菌种抗菌差异较大，而具有选择性抗茵性能。而且芦丁及其配合物抑制4 种细菌的能力强弱顺序相同，比较抑菌强弱得到：Ru－Cu＞Ru－Zn＞Ru－Co＞Ru－Ni＞Ru－Mn＞Ru－Cr＞Ru－Fe＞Ru＞Cu（Ac）；芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最好，原因是由于与细胞磷脂和肽链上的羧基有较强的亲和力，能稳定在细胞膜及溶酶体膜上，从而抑制溶体酶释放炎症物质，一方面可以与菌的转移核糖核酸（tRNA）中的磷酰基键合，抑制了其核酸酶的活性及功能，从而使细菌的生长受到抑制；另一方面，由于形成配合物后，配合物的分子量和共轭效应都增强，脂溶性增强，对细胞膜的穿透或破坏能力增强，使生物体生长和代谢需要的关键成分流失，导致生物体不能完成正常的运转［12］。

2.3 不同浓度芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物的抑菌作用

按1.3.3 的方法实验，其结果见表3。芦丁的7 种改性产物配合物的抑菌作用，在一定浓度范围内随浓度的增大而增强，呈剂量效应关系。在4 种测定的浓度下，芦丁的改性产物配合物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用始终强于大肠埃希菌，而抑菌作用的强弱一致，其强弱为：Ru－Cu＞Ru－Zn＞Ru－Co＞Ru－Ni＞Ru－Mn＞Ru－Cr＞Ru－Fe＞Ru。在浓度增加过程中，芦丁的改性产物配合物抑菌作用增加的幅度始终大于芦丁。在浓度很低，为0. 5 mg/mL 时，芦丁的改性产物配合物对金黄色葡萄球菌仍有较强的抑菌作用，但对大肠埃希菌几乎没有抑菌作用，而芦丁已经没有抑菌作用。

表3 不同浓度芦丁配合物的抑菌效果比较

2.4 芦丁第一过渡系生命元素改性产物配合物抑菌活性的稳定性分析

2.4.1 温度对抑菌效果的影响 按1.3.4 的实验方法测得的温度对抑菌效果影响的实验结果见图1。由图1 可知，随着处理温度的升高，芦丁的改性产物配合物抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性表现为稳定性较好，抑菌效果有所升高，除Ru－Ni、Ru－Cr 变化幅度相对稍大外，其他都变化不大，120 ℃处理后仍然具有较好的抑菌作用，而芦丁在温度小于60 ℃抑菌效果变化平稳，但大于60 ℃后，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用逐渐下降，120 ℃处理后无明显抑菌作用。总体上随着温度升高芦丁的改性产物配合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用略有增强，且抑菌圈直径均大于6 mm。 其抑菌强度规律：Ru－Cu＞Ru－Zn＞Ru－Co＞Ru－Ni＞Ru－Mn＞Ru－Cr＞Ru－Fe＞Ru。

图1 温度对抑菌效果的影响

2.4.2 pH 对抑菌效果的影响 按1.3.4 的实验方法测得的pH 对抑菌效果影响的实验结果见图2。由图2 可知，在pH 为4～8 范围内，芦丁的改性产物配合物抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性表现为稳定性较好，且抑菌效果也好，在pH 为6 时对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，而在pH 大于8 以后，芦丁配合物抑菌作用逐渐下降，到pH 为10时，下降幅度增大。而芦丁在pH 大于6 以后对金黄色葡萄球菌的抑菌效果下降幅度比配合物大。在不同pH 值下，抑菌圈直径均大于6 mm。其抑菌强度规律：Ru－Cu＞Ru－Zn＞Ru－Co＞Ru－Ni＞Ru－Mn＞Ru－Cr＞Ru－Fe＞Ru。综合来看，芦丁的改性产物配合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性均在酸性到中性条件下更稳定，而芦丁对金黄色葡萄球菌的抑菌活性在酸性条件下更稳定。

图2 pH 值对抑菌效果的影响

3 结论

本次研究结果表明，第一过渡系生命元素对芦丁进行化学改性形成配合物后，这一系列的芦丁配合物比芦丁具有更强的抑菌活性，对4 种菌种的抑菌活性大小为：金黄色葡萄球菌＞大肠埃希菌＞枯草杆菌＞啤酒酵母；芦丁配合物抑菌活性的相对大小为：Ru－Cu＞Ru－Zn＞Ru－Co＞Ru－Ni＞Ru－Mn＞Ru－Cr＞Ru－Fe＞Ru，且芦丁配合物对金黄色葡萄球菌的稳定性明显优于芦丁。实验结果提示，第一过渡系生命元素的芦丁配合物可能是生物活性比芦丁更好的新型活性化合物，值得进一步研究和开发利用。

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