肺癌组织P-gp、GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ表达及与Ki-67相关性

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(青岛大学医学院附属青岛市市立医院病理科，山东 青岛 266071)

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一，大多数病人确诊时已到中晚期，失去手术机会，化疗是主要的治疗手段[1]。多药耐药(MDR)是导致肺癌治疗失败的主要原因之一，严重影响了病人的化疗效果和生存率。本文采用免疫组织化学方法检测63例肺癌组织中P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶Ⅱ(GST-Ⅱ)及DNA拓扑异构酶(TOPO-Ⅱ)的表达，探讨它们与细胞核增殖抗原(Ki-67)的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本

收集我院病理科2011年1月—2012年3月因肺癌行手术切除标本63例，术前均未行放疗及化疗。男41例，女22例；年龄35～83岁，中位年龄58岁；肿瘤直径≤3 cm 者30例，> 3 cm者 33例；组织学类型(WHO分类)：鳞癌21例，腺癌24例，小细胞肺癌12例，大细胞癌6例；无淋巴结转移19例，癌转移到附近或远处淋巴结及其他组织器官44例；病理学分级：中、高分化30例，低分化33例；有吸烟史者36例，无吸烟史者27例。所有标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规苏木精-伊红染色。

1.2 免疫组织化学检测

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)分别进行检测，P-gp和GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67一抗及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，用已知阳性肝癌切片作阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

光学显微镜下以胞核、胞膜、胞浆中存在棕黄色颗粒为阳性，其中P-gp的阳性颗粒主要分布于胞质和(或)胞膜，GST-Ⅱ的阳性颗粒主要分布于胞核和(或)胞质，TOPO-Ⅱ和Ki-67的阳性颗粒分布于胞核。根据染色程度和染色阳性细胞百分数进行评分[2]。按染色程度:不着色计为0分，淡黄色计为1分，黄色计为2分，棕褐色计为3分。按染色阳性细胞所占百分比: 着色阳性细胞占计数细胞<5%计为0分，5%～25% 计为1分，26%～50%计为2分，>50%计为3分。将二者评分相乘，0～3分者为阴性，≥4分者为阳性。

1.4 统计学处理

采用卡方检验法分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67表达与其临床病理特征之间的关系，应用Spearman等级相关分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ与Ki-67的相关性。

2 结 果

2.1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和 Ki-67蛋白表达与肺癌临床病理特征的关系

P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67在肺癌组织中的阳性表达率分别为61.9%、63.5%、77.8%和39.7%。P-gp、GST-Ⅱ在非小细胞癌组织的阳性表达率明显高于小细胞癌(χ2=8.561、9.475,P<0.01)。中高分化癌组织中GST-Ⅱ的阳性表达率明显高于低分化癌组织(χ2=6.733,P<0.01)。TOPO-Ⅱ在鳞癌和小细胞癌组织中的阳性表达率明显高于腺癌(χ2=8.259、4.189,P<0.01、0.05)。Ki-67在小细胞癌组织中的阳性表达率明显高于非小细胞癌(χ2=22.532,P<0.01)，在低分化癌组织的阳性表达率明显高于中高分化组织(χ2=9.270,P<0.01)。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67的阳性表达率与肺癌病人的年龄、性别、是否有吸烟史、肿瘤的大小以及有无淋巴结转移等因素均无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67蛋白表达与肺癌临床病理特征的关系(例(χ/%))

2.2 肺癌组织中P-gp、GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表达

在63例肺癌组织中，P-gp和TOPO-Ⅱ的单独表达率分别为3.2%(2/63)和19.0%(12/63)，没有发现GST-Ⅱ的单独表达。P-gp和GST-Ⅱ的共表达率为49.2%(31/63)；GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表达率为9.5%(6/63)；P-gp和TOPO-Ⅱ的共表达率为6.3%(4/63)；P-gp、GST-Ⅱ及TOPO-Ⅱ的共表达率为25.4%(16/63)。有两个或两个以上MDR基因产物共表达率合计为90.5%，明显高于单独基因产物P-gp和TOPO-Ⅱ的表达率(χ2=59.660,P<0.01)。

2.3 肺癌组织中的P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ表达与Ki-67表达的相关性

Ki-67在肺癌组织中的阳性表达与P-gp、GST-Ⅱ的阳性表达之间无显著相关性(P>0.05)，而与TOPO-Ⅱ的表达呈明显正相关(r=0.380，P<0.01)。

3 讨 论

MDR是导致肺癌化疗失败最难解决的问题之一[3]。MDR的产生是多基因、多途径共同作用的结果，同时检测多个MDR基因的表达，可为临床提供更多的信息并指导临床化疗药物的选择。Ki-67作为一种核增殖抗原，是目前检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一[4]。

P-gp是相对分子质量为17万的蛋白产物，生理功能相当于一个药物排除泵，将进入癌细胞内的抗癌药物泵出癌细胞，从而使癌细胞内药物浓度降低，也可使药物在细胞内再分布，出现耐药现象[5-6]。因此，P-gp的表达水平与耐药程度呈正相关。本文结果显示，P-gp在非小细胞癌组织中阳性表达率明显高于小细胞癌，腺癌高于磷癌(大细胞癌例数较少，未做统计)，此结果与临床上小细胞癌化疗最敏感、鳞癌次之、腺癌最差相符。说明P-gp的高表达是非小细胞肺癌产生耐药性的主要原因。本文结果还显示，P-gp的表达与病人年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小以及有无淋巴结转移无关，与国外相关报道相符[7-8]。

GST-Ⅱ是一种药物代谢酶，一方面可以催化亲电物质与谷胱甘肽结合，另一方面与亲脂性细胞毒药物结合增加药物水溶性，促进其代谢，从而降低抗癌药物的细胞毒作用，GST-Ⅱ的阳性表达与肿瘤耐药相关[9]。本文结果显示，GST-Ⅱ的表达与肺癌病理学分型有关，GST-Ⅱ在非小细胞癌中的阳性表达率明显高于小细胞癌，与临床上小细胞肺癌首次化疗敏感相符。由此可以认为，GST-Ⅱ的高表达是非小细胞癌产生耐药性的原因之一。中高分化癌与低分化癌相比，前者GST-Ⅱ的阳性表达率明显高于后者，说明分化较高的肺癌耐药性较强[10]。本文结果还显示，GST-Ⅱ的表达与病人年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小以及有无淋巴结转移无关。

TOPO-Ⅱ是DNA复制和转录所需要的基本核酶，一方面作为细胞的增殖指数，另一方面作为抗癌药物的靶点指数。化疗药物如VP16、替尼泊苷和阿霉素等通过与TOPO-Ⅱ结合造成DNA复制和转录异常，因此TOPO-Ⅱ是肿瘤治疗的主要靶酶。本文的研究结果显示，TOPO-Ⅱ在鳞癌和小细胞癌中的阳性表达率明显高于腺癌，提示TOPO-Ⅱ的低水平表达使VP16等抑制剂丧失作用靶点，无法抑制TOPO-Ⅱ发挥作用，所以TOPO-Ⅱ可作为一种潜在的预示化疗敏感性的标记物[11]。本文结果还显示，TOPO-Ⅱ的表达与病人年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小以及有无淋巴结转移无关。

有文献报道，Ki-67阳性表达率与肺癌的侵袭力、恶性程度呈正相关[12]。本文结果显示，Ki-67的表达与肺癌组织类型及分化程度有关，在小细胞癌组织表达明显高于非小细胞癌，在低分化癌组织表达明显高于中高分化癌，说明癌组织分化程度越低，Ki-67表达越高，Ki-67表达与肺癌的恶性程度呈正相关。本文结果还显示，Ki-67的表达与P-gp、GST-Ⅱ的表达之间无显著相关性，与TOPO-Ⅱ的表达呈明显正相关。说明TOPO-Ⅱ可作为一种研究肿瘤细胞增殖活性的特异性指标[13]，同时检测Ki-67和TOPO-Ⅱ可以更好地判断瘤细胞的增殖状态。

有研究表明，非小细胞肺癌存在多种耐药基因共同表达的现象[14]。本文结果显示，有两个或两个以上MDR基因产物的共表达率明显高于单独基因产物P-gp、GST-Ⅱ的表达率，提示肺癌耐药的单基因作用较弱，其耐药机制是多种基因共同作用的结果。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ三者可能相互依赖，共同作用，具体机制有待于进一步研究。因此，同时检测P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ可为临床化疗提供更多的耐药信息，进而指导临床对化疗药物的选择。

综上所述，P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ共同参与了肺癌的耐药机制，三者相互依赖，共同作用；Ki-67与肺癌的恶性程度呈正相关。临床上同时检测上述4种基因，对于揭示肺癌耐药的原因，估计化疗效果，判断预后，以及指导合理选择化疗药物，制定有效的化疗方案，延长肺癌病人的生存期意义很大。

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