复宫宁对大鼠异位子宫内膜细胞形态及caspase-3 和Bcl-2 蛋白表达的影响*

黄越燕， 肖 纯， 尹满香， 刘春花， 乔玉丹， 施 旻， 王晓敏， 徐优慧

(1嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴314001;2江西中医学院基础医学院，江西 南昌330004;3武警浙江省总队医院病理科，浙江 嘉兴314000)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是妇科常见病，近年来其发病率逐年增加［1］。EMT 的发病原因及发病机制尚未清楚，故给治疗带来了一定的困难。现代医学治疗本病多以药物和手术为主，因其副作用明显，复发率较高，常难以为患者接受。中医药治疗子宫内膜异位症积累了丰富的临床经验［2-4］。复宫宁是江西省中医院临床治疗内异症的经验方，具有活血化瘀、通络和消瘕散结之功，本实验主要采用HE 染色、透射电镜技术及免疫组化方法观察复宫宁实验组异位内膜细胞形态结构和凋亡蛋白表达的变化，并与模型组和达那唑治疗组相比较，从凋亡的角度，以探讨复宫宁制剂的作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 药品制备、试剂

复宫宁制剂由三棱、莪术、红花、蒲黄、延胡、白芍、菟丝子、巴戟天等中药经水提法制成每mL 含生药2 g，大鼠每天剂量1.0 g/kg 和2.0 g/kg。达那唑(danazol)胶囊:上海医药有限公司华联制药厂，产品批号为090801，用蒸馏水配成每mL 含胶囊25 mg。Caspase-3 和Bcl-2 抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 动物模型制作

健康雌性SD 大鼠，50 只，体重(200 ±50)g，由南昌大学实验动物中心提供，在江西中医学院病理实验室完成实验。实验动物适应性饲养15 d，每天同一时间阴道涂片，观察大鼠动情周期。在第3 个动情周期的动情期，采用自体子宫内膜移植法［5］建立EMT 大鼠模型。以1%戊巴比妥钠麻醉，开腹找到子宫，切下左侧子宫角中段长约1 cm，行端对端吻合术。将剥离的子宫内膜组织剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的内膜块，缝合在左侧子宫系膜，缝合切口。术后动物分笼单放，让其自然苏醒。常规饲养。

3 分组及给药

造模4 周后取经剖腹证实造模成功的大鼠40只，随机分为4 组，即:复宫宁治疗1 组、复宫宁治疗2 组，达那唑治疗组和模型组，每组10 只。其中复宫宁1 组和2 组分别按1.0 g·kg－1·d－1和2.0 g·kg－1·d－1给药，达那唑组以100 mg·kg－1·d－1给药，模型组给予等容量生理盐水。每天1 次灌胃。持续给药4 周。

4 仪器

SZK 型医用超净工作台，PH140A 型培养箱/干燥箱，LXJ-64-01 型离心机，SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器，BX-41 型光学显微镜及摄像系统，Q550CW 图像信息采集与分析系统等。

5 标本的采集与处理

于末次用药24 h 后，剖腹，取下异位病灶，分离周围黏连组织。取右侧子宫中段(在位内膜)1 cm和异位内膜作为标本，置于10% 中性甲醛溶液和2.5%戊二醛中固定备用。移植物(异位病灶)成活标准:肉眼可见移植物增大，呈隆起的小泡状，有些形成多房的囊肿，充满黄色或清亮浆液，被结缔组织覆盖并有血管形成，部分移植物呈黄色或褐色小结。双脚规测量移植物体积(长×宽×高)，单位mm3。以2.5%戊二醛固定的组织用于制作超微切片，透射电镜观察子宫内膜细胞的凋亡情况。

6 异位和在位内膜HE 染色及观察

标本固定48 h 后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚3 ～4 μm)、脱蜡、水化，HE 染色观察。

7 免疫组化法分析活化caspase-3 及Bcl-2 蛋白的表达

将在位、异位内膜石蜡切片标本，进行免疫组化染色，采用SP 法染色，DAB 显色。结果判定:采用H-score 法［6］，由两位病理医师双盲观察染色均匀的切片，每张切片随机选择5 个不同高倍视野(×400)观察选择在位、异位内膜组织的被覆上皮所有细胞，记录阳性染色(即胞质或/和胞膜呈棕黄色)的细胞百分数并计分。 ＜5%的阳性细胞，计0 分;5% ～10%的细胞呈阳性，计1 分;11% ～50%的细胞呈阳性，计2 分;＞50%的细胞呈阳性，计3 分。细胞着色强度以多数阳性细胞呈现的染色(棕黄色)为强着色，计3 分;淡黄色为弱阳性，计1 分;两者之间的黄色为中等着色，计2 分。将阳性细胞百分数计分和染色强度计分相加，为免疫组化积分(两位医师观察结果如有不同，取二者计分之和的平均数)。

8 统计学处理

用SPSS 13.0 统计软件进行处理。数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析和SNK-q 检验，采用Spearman 等级相关分析检验caspase-3 及Bcl-2 蛋白表达的相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 复宫宁对异位囊肿体积的影响

用药前各组病灶体积无差异;用药后，复宫宁与达那唑对大鼠异位内膜均具有明显的抑制作用。复宫宁组病灶明显缩小，与模型组和用药前相比均有显著差异(P ＜0.01);与达那唑组相比无显著差异(P ＞0. 05)。达那唑组与模型组比病灶体积缩小(P ＜0.01)，与用药前比病灶体积缩小(P ＜0.01)。模型组自身前后比较，体积不但无缩小，反而继续生长(P ＜0.05)，说明病变在发展中，见表1。

表1 复宫宁对异位囊肿体积的影响Table 1. Effect of Fugongning on volume of ectopic cysts in rats with endometriosis(mm3.Mean±SD.n=10)

2 组织形态学变化

光镜下模型组异位内膜形成封闭的环形结构，较在位内膜薄，内膜上皮为单层柱状、立方状，大部分上皮细胞有分泌现象(可见核下空泡)，可见薄层间质和丰富的血管，有的见少量腺体或少量含铁血黄素及中性粒细胞浸润，见图1。达那唑组异位、在位内膜腺上皮层明显变薄，细胞呈柱状或低柱状甚至扁平状松散排列，细胞核不规则，位置不定，见图2。复宫宁组异位内膜上皮呈低柱状、扁平状，单层松散排列，部分病灶内膜萎缩呈线状或者内膜脱落、消失。间质细胞明显减少，甚至缺如，周围血管少。仅个别病灶内见少量腺体。而在位的子宫内膜则无明显变化，上皮细胞、腺体及间质细胞均无萎缩现象，见图3。

Figure 1. Endometrial tissues in model group (HE staining，×200). A:endometriotic lesion，with high columnar epithelium and vascular hyperemia;B:cystic endometriotic lesion，with columnar glandular epithelium and inflammatory cells in the cavity;C:eutopic endometrium，with a few inflammatory cells infiltrating in glandular epithelium，and nondecreasing glands.图1 模型组子宫内膜组织

Figure 2. Endometrial tissues in danazol treatment group (HE staining，× 200). A:high-columnar glandular epithelial hyperplasia in endometriotic lesion around ovarian;B:glandular epithelial hyperplasia and inflammation being inhibited in endometriotic lesion;C:various degrees of atrophy in eutopic endometrial epithelium and glands.图2 达那唑治疗组子宫内膜组织

Figure 3. Endometrial tissues in Fugongning treatment group(HE staining，×100). A:significantly-reduced endometriotic lesion，with little intracavitary secretion，and cyst wall fibrosis;B:atrophy and lowering in part of endometriotic epithelium，and cyst wall hemosiderosis;C:abundant glands in eutopic endometrium，with secretion but no atrophy.图3 复宫宁治疗组子宫内膜组织

3 超微结构改变

透射电镜显示:模型组异位内膜上皮结构完好，细胞界限清晰，有细纤毛和溶酶体，线粒体、高尔基体等细胞器。达那唑组异位内膜上皮可见纤毛减少或消失，线粒体等细胞器结构不清，部分上皮细胞凋亡。复宫宁组异位内膜上皮胞体收缩，失去微绒毛，胞浆浓缩，核染色质密度增高并凝聚于核膜周边，核仁裂解;细胞膜内陷和凋亡小体形成，见图4。

Figure 4. Ultrastructual changes of endometrial epithilial cells. A:model group (×4 000);B:danazol treatment group (×4 000);C:Fugongning treatment 1 group (×4 000);D:Fugongning treatment 2 group (×8 000).图4 子宫内膜上皮细胞的超微病理学改变

4 活化caspase-3 蛋白表达特征

活化caspase-3 蛋白在各组在位、异位内膜的腺上皮细胞和间质细胞的胞质中表达，呈不同程度黄色或棕黄色的颗粒，见图5。阴性对照片中所有细胞均无着色。各组在位内膜活化caspase-3 蛋白表达水平较一致(P ＞0.05);各组异位内膜活化caspase-3蛋白表达水平不同，复宫宁1 组、2 组活化caspase-3蛋白表达明显高于模型组(P ＜0.01)。复宫宁1 组、2 组在位内膜活化caspase-3 蛋白表达水平明显低于异位内膜(P ＜0.01)，模型组和达那唑组在位内膜与异位内膜活化caspase-3 蛋白表达无显著差异(P ＞0.05)，见表2。

Figure 5. Activated caspase-3 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining). A:low expression in ectopic endometrium from model group(×400);B:high expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group(×400);C:low expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group(×200).图5 子宫内膜组织活化caspase-3 蛋白的表达

表2 各组在位、异位内膜活化caspase-3 蛋白表达水平的比较Table 2. Expression of activated caspase-3 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean±SD. n=10)

5 Bcl-2 蛋白表达特征

Bcl-2 蛋白主要表达于各组在位、异位内膜的腺上皮细胞，主要在胞质和胞膜表达，表现为不同程度黄色的颗粒，淋巴细胞和子宫平滑肌细胞可呈阳性表达，子宫内膜间质未见表达，见图6。各组在位内膜Bcl-2 蛋白表达水平较一致(P ＞0.05);各组异位内膜Bcl-2 蛋白表达水平不同，复宫宁1 组、2 组Bcl-2 蛋白表达明显低于模型组(P ＜0.01)。复宫宁1组、2 组异位内膜Bcl-2 蛋白表达水平明显低于在位内膜(P ＜0.01)。模型组恰恰相反，异位内膜Bcl-2蛋白表达水平明显高于在位内膜(P ＜0.05)。达那唑组异位内膜与在位内膜Bcl-2 蛋白表达水平无显著差异(P ＞0.05)，见表3。

Figure 6. Bcl-2 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining，×200). A:high expression in ectopic endometrium from model group;B:low expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group;C:high expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group.图6 子宫内膜组织Bcl-2 蛋白的表达

表3 各组在位、异位内膜Bcl-2 蛋白表达水平的比较Table 3. Expression of Bcl-2 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean ±SD. n =10)

6 各组异位内膜Bcl-2 与caspase-3 表达的相关性

经Spearman 等级相关分析，各组异位内膜bcl-2蛋白的表达水平与caspase-3 蛋白的表达水平呈负相关(r=－0.377，P ＜0.05);而各组在位内膜两者的表达未显示其相关性。

讨 论

EMT 是具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外身体的其它部位引起的疾患，其临床表现为痛经、月经失调、不孕、盆腔包块等。病情反复，临床难以根治。EMT 发病机制尚不完全清楚，目前多数学者认为，它可能是一种在免疫及细胞凋亡异常基础上发生经血逆流而导致的综合结果［7］，而凋亡是子宫内膜细胞保持周期性结构和功能稳定的关键因素，异位内膜细胞得以在宫腔外种植并继续存活，与其对凋亡的抵抗力增强有关［8］。子宫内膜入盆、腹腔后，在异位逃避机体免疫系统的监视而存活、种植，为EMT 的发病创造了有利条件。

中医对内异症从病因病机、治法治则上形成了较完善体系并在一定程度上达成共识:认为多因外感寒热湿邪，或内伤七情及妇科宫腔手术创伤等所致，“瘀血阻滞胞宫、冲任”是其基本病机，治疗上大多以活血化瘀为大法。针对内异症的病因病机，结合本院的临床经验，确立以活血化瘀、消瘕散结为治疗原则的复宫宁制剂，同时兼顾导致淤血内阻的其它相关因素，理气行血、散寒温经、补肾益精。三棱、莪术消癥散结，能减少盆腔黏连，化散囊肿、包块等子宫内膜异位病灶;红花、蒲黄等活血通经、散瘀止痛;佐以巴戟天、淫羊藿、菟丝子补肾益精、温里散寒，使血得温则行，瘀血得消;加入延胡、白芍行气止痛，使气行则血行。全方药简功专，组方合理，具有免疫调节和诱导凋亡的功能，有效缩小或消除异位病灶，缓解痛经，改善月经不调，还可能提高内异症伴不孕患者的受孕率。

本实验采用经典的手术移植自体子宫内膜，建立EMT 模型，实验结果表明模型组异位内膜增生，产生局部黏连，提示造模成功;复宫宁2 个剂量组均有不同程度的抑制异位内膜的增生，使其萎缩、退变、凋亡。本实验观察各组在位子宫内膜均未见凋亡现象，模型组异位内膜偶见凋亡细胞，这和文献［9-12］报道一致。用复宫宁后，异位上皮细胞凋亡数明显增多，与徐邦生等［13］研究消症汤对子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜细胞增殖和凋亡的结果一致。复宫宁组异位内膜细胞凋亡现象明显:电镜下可见核染色质边聚成新月状，有的凝集成块状，或形成凋亡小体。有的细胞胞浆中有较多的溶酶体和肿胀空泡变的线粒体。提示复宫宁的疗效机制，一方面是其促进了异位内膜上皮细胞的凋亡;另一方面，增多的溶酶体也可促进细胞的自溶;复宫宁致线粒体的空泡变性也十分明显，必然引起细胞的能量代谢障碍，进一步使异位内膜细胞的萎缩和变性，最终促进异位病灶缩小和消失。本研究还通过免疫组化观察，发现在复宫宁组，EMT 大鼠异位内膜腺上皮细胞Bcl-2 蛋白表达水平明显低于其在位内膜，但模型组中却相反。复宫宁组大鼠异位内膜腺上皮细胞caspase-3 蛋白的表达水平则明显高于其在位内膜，达那唑组中两者相差不明显。我们将各组异位内膜Bcl-2 与caspase-3 表达的相关性经Spearman 等级相关分析，各组异位内膜Bcl-2 蛋白的表达水平与其caspase-3 蛋白的表达水平呈负相关(r =－0.377，P＜0.05);而在各组在位内膜两者的表达未显示其相关性。由此可见，复宫宁通过激活细胞中的caspase酶原活性及降低Bcl-2 蛋白在EMT 中的高表达，诱导异位内膜细胞的凋亡，而起到对异位内膜的抑制作用。Harada 等［14］进行了EMT 在位及异位内膜与正常女性子宫内膜对凋亡敏感性的比较实验发现，EMT 患者在位及异位内膜对凋亡的敏感性均明显下降，异位者较在位者下降更明显，且无周期性变化，推测内膜组织自发凋亡减弱和对凋亡的敏感性降低是EMT 发生的原因之一。本实验中，复宫宁治疗组异位内膜有明显凋亡现象，而在位内膜无明显凋亡，是否通过影响内膜细胞对凋亡信号的敏感性不同来诱导细胞的凋亡，还有待于进一步研究探讨。前期实验中，我们发现，复宫宁制剂能够通过降低异位内膜ER 和PR 的表达而起到抑制异位内膜生长的作用［15］。我们观察到，达那唑能有效降低EMT 大鼠血清E2和P 水平，复宫宁制剂也有轻度降低EMT 大鼠血清E2和P 的作用，模型组血清E2和P 含量明显高于正常组，说明复宫宁可以通过抑制大鼠E2和P 的异常分泌达到治疗EMT 的目的。复宫宁制剂兼顾活血补肾祛瘀，对病人从整体进行调节，而且毒副作用小，可以长期服用，减少复发率。复宫宁能诱导异位子宫内膜细胞凋亡，与达那唑疗效相似，其调控机制很可能与E2水平下降密切相关。但复宫宁降低E2 的作用不及达那唑，可能因此而具有保护正常子宫内膜的作用。

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