阿托伐他汀对碘普罗胺引起的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响*

邹文博， 苏津自， 许昌声， 蔡文钦， 马雯雯， 陈秀平， 王芳兵

(福建医科大学附属第一医院1高血压研究所，2心血管内科，福建 福州350005;3华中科技大学同济医学院，湖北 武汉430030)

随着各种影像学检查和介入诊疗技术的发展，含碘造影剂的使用日益频繁，造影剂急性肾损伤(contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI)的发病率随之增加。CI-AKI 已经成为医源性急性肾功能不全的第三大原因，在急性肾功能损害病例中，大约有10%是由CI-AKI 引起的［1］。此外，CI-AKI 可增加心脑血管事件的发生率和死亡率，加重靶器官的损伤，并带来延长住院时间和增加诊疗费用等诸多问题［2］。CI-AKI 的危险因素已被广泛地研究和报道，其中糖尿病被公认为CI-AKI 的重要独立危险因素之一，在接受介入治疗的正常人群中，CI-AKI 发病率不足1%，而在糖尿病人群中高达29.4%［3］。一项随访研究［4］显示，有糖尿病基础疾病的CI-AKI 患者，其2 年生存率比CI-AKI 无糖尿病的患者明显降低。因此，如何有效地预防糖尿病人群中CI-AKI 的发生和发展，成为了介入科医师与肾内科医师共同面临的课题。目前他汀类药物是否对CI-AKI 有保护作用目前仍存在争议，为此我们在糖尿病的基础上，建立了CI-AKI 的动物模型，初步探讨阿托伐他汀对糖尿病CI-AIK 是否有保护作用及可能存在的机制。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级Wistar 大鼠(250 ～300 g)购自上海斯莱克实验动物中心(No. SCXK2007-0005)。实验大鼠每笼4 ～5 只，饲养在恒温(22 ±2)℃、恒湿(55 ±5)%，人工光照明暗各12 h 的饲养室内，标准饲料和自来水自由饮食。

2 主要方法

2.1 模型建立与分组 60 只清洁级Wistar 大鼠随机分为正常组(N 组，n =8)及糖尿病造模组(n =52)，适应性喂养2 周后，造模组以腹腔单剂量注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ;Sigma)40 mg/kg(溶解在10 mmol/L 枸橼酸缓冲液中，pH 4.2 ～4.5)建立糖尿病模型，分别于72 h、5 d 和1 周后断尾取血测血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L 为标准确定糖尿病大鼠模型是否成功，对于血糖未达标大鼠，给予40 mg/kg 的追加剂量至达标。普通饮食、自由摄水饲养8 周后，选取糖尿病模型成功者，随机分为糖尿病对照组(DM 组)、糖尿病+ 造影剂组(DM + CM组)、糖尿病+造影剂+5 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀组(ATO1 组)、糖尿病+造影剂+10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀组(ATO2 组)和糖尿病+造影剂+30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀组(ATO3 组)。将阿托伐他汀钙片(辉瑞公司)研磨后与2 mL 饮用水混合成混悬液，分别以5、10 和30 mg·kg-1·d-1灌胃，N 组、DM 组和CM 组给予同体积饮用水连续灌胃5 d。灌胃5 d 后 以12 mL/kg 单次剂量经尾静脉注射碘普罗胺注射液，N 组和DM 组分别给予同体积的生理盐水。

2.2 标本收集 注射造影剂24 h 后，用代谢笼收集24 h 尿液，离心后取上清测尿肌酐和尿微量白蛋白;注射造影剂48 h 后，处死动物，经腹主动脉收集血标本并摘取左肾，称重，并计算肾指数［肾重(kidneyweight，KW)/体重(body weight，BW)］;血液标本离心后，取上清，测血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);左肾部分置于10%甲醛溶液中固定，待作光镜检查及相关的组织学检查。其余肾脏标本待分离出皮质和髓质后，置于-80 ℃冰箱保存，待测肾脏Bax 和Bcl-2 蛋白的表达。

2.3 血糖检测 血糖采用断尾取血法，应用血糖试纸和血糖仪(拜安捷公司)测定。

2.4 生化指标测定 SCr、BUN、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿肌酐(urine creatinine，UCr)和24 h 尿微量白蛋(24-hour urine albumin，24 h-UAlb)等指标由福建医科大学附属第一医院检验科日立7150 型全自动生化分析仪检测;并计算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)和24 h 尿微量白蛋白排泄率(24-hour urinary albumin excretion rate，24 h-UAER)。CCr=U×V/P，U 表示尿肌酐含量(μmol/L)，V 表示尿量［mL·min-1·(100 g)-1］，P 表示血肌酐水平(μmol·L-1)，CCr单位为mL·min-1·(100 g)-1;24 h-UAER= 24 h-UAlb/(24 ×60)，24 h-UAER 单位为μg·min-1。

2.5 形态学观察 将固定于10%甲醛中的肾组织，经石蜡包埋后切成3μm 厚的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇进水，水冲洗后于苏木素液浸泡10 ～20 min;水冲洗;1%盐酸乙醇分化;1% 氨水还原;1%伊红浸泡10 min;水冲洗;梯度乙醇脱水;二甲苯透明2 h;环氧树脂封片。在光学显微镜下双盲观察，每张切片于400 倍显微镜下随机选取10 个肾小管间质视野，进行肾小管损伤程度评分，评分标准如下:0 分，肾小管正常，无损伤;1 分，肾小管轻度损伤(受损肾小管＜25%);2 分，肾小管中度损伤(受损肾小管25% ～75%);3 分，肾小管重度损伤(受损肾小管＞75%)。以每张切片10 个视野评分总和的均值作为肾小管损伤评分。

2.6 TUNEL 定量分析 按Dead EndTMColorimetric TUNEL System 试剂盒(罗氏公司)说明书进行操作。每组每只大鼠随机选取5 个高倍镜视野，每个视野计数TUNEL 阳性肾小管上皮细胞数，计算其凋亡率。

2.7 免疫组织化学二步法检测肾脏Bax 和Bcl-2 表达 石蜡包埋的肾组织进行3 μm 厚的连续切片，脱蜡水化;3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30 min，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗体，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗聚合物室温孵育30 min，DAB 染色1 min，苏木素复染2 min，脱水，透明，封固。

2.8 Western blotting 法测定肾脏Bax 和Bcl-2 表达

分组处理细胞后提取各组肾脏组织蛋白，取20 μL 10% SDS-PAGE 凝胶电泳(120 mV)分离蛋白，继之80 mA转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗体，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗(HRP 标记羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h，化学发光1 min，显影，定影，于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照条带β-actin 灰度分析，各蛋白的表达强度为二者灰度的比值。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件包分析。数据用均数±标准差(mean ± SD)表示，组间比较采用One-way ANOVA 分析，LSD 法进行多重比较。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠一般情况比较

各组间体重、肾重、ALT 和ALT 均无显著变化(P ＞0.05);与N 组比较，各组糖尿病大鼠的血糖水平均有明显升高(P ＜0.01)，但各组糖尿病大鼠血糖水平无明显差异(P ＞0.05)，见表1。

表1 各组大鼠基本情况比较Table 1. Comparison of basic information in each group (Mean±SD.n=8)

2 各组SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平

与N 组比较，DM 组SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05);与N 组和DM 组比较，DM+CM 组SCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05)，CCr 水平降低(P ＜0.05);与DM +CM 组比较，3 种剂量他汀治疗组Scr 均有明显下降(P ＜0.05)，且ATO3 组较ATO1 和ATO2 组均有明显下降(P ＜0.05);ATO2 和ATO3 组CCr 水平随剂量增加均有明显升高(P ＜0.05)，且ATO2 与ATO3 组间有显著差异(P ＜0.05);ATO2 及ATO3 组BUN 和24 h-UAER 水平较DM+CM 组明显降低(P ＜0.05)，见图1。

Figure 1. Comparisons of SCr，CCr，24 h-BUNR and UAE levels in each group. Mean ±SD. n =8. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.图1 各组大鼠SCr、CCr、BUN 及24 h-UAER 水平比较

3 病理形态学改变

如图2 所示，CI-AKI 的病理变化主要在髓质区。与N 组和DM 组比较，DM +CM 组髓质区出现较多的小管上皮细胞脱落、坏死，炎症浸润及空泡样改变，部分管腔出现蛋白管型、细胞管型，甚至闭塞变形;ATO2 及ATO3 组与DM+CM 组比较，上述病理改变明显减轻。与N 组和DM 组比较，DM +CM 组病理评分均高于前两者(P ＜0.05);与DM+CM 组、ATO1 组和ATO2 组比较，ATO3 病理评分较三者低(P ＜0.05);而ATO1 与DM +CM 组评分未见明显差异(P ＞0.05)。

Figure 2. Analysis of histological changes in each group (HE staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. ▲:protein casts;↑:tubular vacuolar degeneration;△:infiltration of inflammatory cells and cell casts. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.图2 各组大鼠肾组织病理形态学改变及病理评分分析

4 TUNEL 法标记的凋亡细胞水平

在显微镜下，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞。N 组内仅见个别阳性细胞核;DM 组较N 组凋亡明显增加;与N 组和DM 组比较，DM+CM 组可见大量棕黄色凋亡细胞核;阿托伐他汀能明显抑制小管上皮细胞凋亡，不同浓度的阿托伐他汀干预后凋亡细胞明显减少，中浓度阿托伐他汀组的晚期凋亡细胞较DM+CM 组明显减少，高浓度阿托伐他汀组中仅见少数凋亡细胞，见图3。

Figure 3. Analysis of TUNEL-positive apoptotic tubular epithelial cells in each group (×400). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;○P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.图3 TUNEL 法检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况

5 免疫组织化学检测Bax 和Bcl-2 蛋白表达

图4、5 显示，Bax 和Bcl-2 阳性表达分别为棕黄色，Bax 和Bcl-2 在肾小管上皮细胞的胞质和胞膜均有表达。N 组和DM 组Bcl-2 和Bax 表达均较低，DM组Bax 蛋白表达较N 组高，而Bcl-2 蛋白较N 组低;DM+CM 组Bax 蛋白表达与对照组比较显著增高，而Bcl-2 表达与对照组比较显著降低(P ＜0.05);与DM+CM 组比较，Bcl-2 随着阿托伐他汀剂量的升高表达增高(P ＜0.05)，而Bax 随阿托伐他汀剂量的升高表达降低(P ＜0.05)，高浓度阿托伐他汀组较低剂量及中剂量阿托伐他汀组Bcl-2 表达明显升高(P＜0.05)，而Bax 表达明显降低(P ＜0.05)。

Figure 4. Expression of Bax protein in each group (immunohistochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.图4 免疫组化检测各组大鼠肾脏Bax 蛋白表达

6 Western blotting 法检测Bax 和Bcl-2 蛋白表达

如图6 所示，DM 组与N 组比较，Bcl-2 蛋白表达明显减少，Bax 蛋白表达明显增多;与N 组和DM 组比较，CM+DM 组Bcl-2 蛋白表达下调，Bax 蛋白表达上调;与CM+DM 组比较，3 种剂量阿托伐他汀组Bcl-2 蛋白表达上调，Bax 蛋白表达下调。而对于Bcl-2/Bax 比值，DM 组Bcl-2/Bax 比值明显高于N 组(P ＜0.05);DM + CM 组Bcl-2/Bax 比值较N 组和DM 组明显下降(P ＜0.05);与DM+CM 组比较，中剂量和大剂量阿托伐他汀组Bcl-2/Bax 比值升高，而小剂量阿托伐他汀组无显著差异(P ＞0.05)。

Figure 5. Expression of Bcl-2 protein in in each group (immunocytochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.图5 免疫组化检测各组大鼠肾脏Bcl-2 蛋白表达

Figure 6. Western blotting analysis of Bcl-2 and Bax protein expression in each group. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.图6 Western blotting 法检测各组Bax 和Bcl-2 蛋白的表达

讨 论

目前CI-AKI 的发病机制尚未明确，有研究表明造影剂引起的缺血缺氧是CI-AKI 最主要机制之一。在含碘造影剂进入肾血管后，肾血管血流动力学效应呈双时相，首先是肾脏血管短暂性舒张和肾血流量增加阶段，约持续20 min 后，肾血管进入强烈痉挛性收缩阶段，此过程可持续4 h 或者更久，引起超过50%的肾血流量急剧减少，从而造成髓质缺血缺氧性损伤［5］。而作为CI-AKI 独立危险因素之一的糖尿病可以加剧血管收缩，进一步加重造影剂引起的髓质局部灌注不足［3］。

CI-AKI 的缺血缺氧性损伤病理表现为髓质区域的肾小管上皮细胞凋亡、坏死及小管塌陷，肾小管上皮细胞的线粒体肿胀，而体外条件下的肾小管细胞株，在加入对比剂后也可见明显的线粒体酶活性及线粒体膜电位的改变［6］。Zager 等［7］的研究表明，含碘造影剂可以引起肾小管细胞的线粒体损伤。而在线粒体损伤后，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeabilty transition pore，MPTP)开放，使线粒体膜间隙内的细胞色素C 大量释放至胞质中，最终诱导依赖及非依赖性天冬肽酶途径激活的细胞凋亡［8］。线粒体外膜上的Bcl-2 家族蛋白，尤其是抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 在MPTP 开放和关闭过程中起到关键的调控作用;Lee 等［9］对糖尿病模型大鼠注射对比剂后，发现在髓攀升支粗段组织检测到了凋亡标志性DNA 片段，最终肾小管上皮细胞出现程序性死亡。Yano 等［11］进一步研究发现，造影剂上调促凋亡基因bax mRNA 的表达，并下调抑凋亡基因bcl-2 mRNA 表达，导致细胞的凋亡。此外，金可可等［11］发现，STZ 诱导的糖尿病大鼠可能通过诱导肾小管上皮细胞Bax 蛋白和抑制Bcl-2 蛋白表达，促进肾小管上皮细胞的凋亡。本研究通过凋亡相关蛋白Bcl-2 和Bax 检测发现，与对照组比较，糖尿病较对照组肾小管细胞凋亡增加，且Bcl-2/Bax 比值降低;而对比剂不仅促进肾小管上皮细胞的凋亡，而且使Bcl-2 表达减少，Bax 表达增强，从而证实CI-AKI的发病可能与糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡增加有关，其机制可能与对比剂以及糖尿病干扰Bcl-2蛋白和Bax 蛋白表达作用有关。

目前，对凋亡研究的注意力集中在凋亡更早的过程，即一系列细胞内具有关键作用的蛋白质参与过程，Bcl-2 和Bax 涉及这一过程。在凋亡及其调控机制研究中，最主要的机制是Bcl-2 家族成员的参与。CI-AKI 属于一过性的早期病理损伤性疾病，因此在损伤早期进行相应治疗显得尤为重要。CI-AKI的预防药物的效果仍存在争议，而基于他汀具有广泛的心血管保护作用，包括改善血管内皮功能、增加内皮源性一氧化氮的生物利用度、抗氧化、抗炎症等作用，他汀对CI-AKI 的预防作用受到极大关注及重视［12-14］。尽管有研究发现阿托伐他汀可诱导平滑肌细胞、横纹肌细胞凋亡［15-16］。但是有研究［17］提出阿托伐他汀可以减少肾小管上皮细胞的凋亡，从而改善输尿管梗阻引起的肾功能损害;Haylor 等［18］也证实，阿托伐他汀可通过抑制肾小管上皮细胞caspase-3 活化，发挥抗凋亡作用，进而改善肾脏缺血再灌注损伤。这可能与阿托伐他汀的抗凋亡作用对不同细胞有选择性。

本研究表明，阿托伐他汀可以上调Bcl-2 蛋白和下调Bax 蛋白表达水平，降低含碘造影剂诱导的肾小管上皮细胞的凋亡率，并改善造影剂引起的肾功能的急性损害。这些结果提示他汀类药物抑制对比剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的效应，可能与上调Bcl-2 蛋白和下调Bax 蛋白表达水平有关，从而发挥其肾脏保护作用。这一结论不仅与国内外研究报道一致，而且表明了他汀类药物除抗炎、抗氧化应激和改善血管内皮功能等作用外，还有抑制对比剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用。同时我们还发现，与5 mg·kg-1·d-1以及10 mg·kg-1·d-1的阿托伐他汀治疗组比较，30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀可明显降低对比剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡率，大鼠的肾功能以及Bcl-2/Bax 比值均有显著改善。这提示在接受造影剂的介入治疗或影像学检查之前，负荷剂量他汀类药物的强化治疗可以使易患CI-AKI 的糖尿病高危人群的获益最大。这一结论为我们在他汀类药物早期、短程、强化治疗预防CI-AKI提供了有力证据。

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