超声微泡靶向递送aFGF 对糖尿病心肌病的治疗作用及其机制研究*

田新桥， 茹 翱， 赵应征， 李剑敏， 郑 磊， 金可可， 张 超

(1温州医科大学附属第二医院超声科，浙江 温州325027;2 温州医科大学，浙江 温州325035;3温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州325027)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetes milletus，DM)引起的一系列心肌代谢和结构异常的病理改变，为糖尿病的常见慢性并发症之一。流行病学资料显示，DCM 患者日益增多，已成为DM 患者易发心衰和死亡的主要原因［1］，严重影响患者的预后。然而，目前临床上尚缺乏对DCM 的有效治疗方法。研究证实，心肌微血管病变、心肌间质纤维化及细胞凋亡为DCM 的特征性改变，因此，促微血管新生，减轻心肌间质纤维化及抗心肌细胞凋亡可能成为治疗DCM 的策略之一。酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)最初由Thomas 于1984 年从牛脑中分离纯化得到，具有诱导血管新生、促进胶原水解、抗氧化损伤及神经营养保护等多种生物学作用［2-3］。因此，aFGF 对DCM 防治应具有较大潜力。然而，由于aFGF 在体外极易被氧化失活，且缺乏高效安全的心肌靶向递送载体，故aFGF 目前在临床上仅局限于外用治疗烧伤、创伤、皮肤溃疡及皮肤护理等方面，其在体研究仍处于初步研究阶段，且多集中于缺血性心脏病动物实验，如学者Geist 等［3］在新西兰兔缺血心肌梗死区注射aFGF，1 周后观察证实aFGF 可以增加缺血梗死区心肌血流量及微血管密度。迄今鲜见aFGF 用于治疗DCM 的报道。

近年来，以超声微泡作为药物/基因递送载体进行疾病靶向治疗的报道日益增多，超声微泡目前已成为又一种新的药物转载系统。本研究选用SonoVue 超声微泡作为aFGF 的递送载体并结合超声靶向微泡击破技术(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)对DCM 大鼠进行干预，旨在观察该方法对DCM 大鼠左心室舒缩功能的保护作用并初步探讨其可能机制，为DCM 的防治研究提供新的思路和实验依据。

材 料 和 方 法

1 动物

健康雄性SPF 级Sprague-Dawley 大鼠40 只，鼠龄40 ～50 d，体质量170 ～230 g，由温州医学院实验动物中心代购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物使用许可证号为SYXK(浙)2010-0150。

2 主要试剂

aFGF 干粉由温州医科大学药学院提供(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心研制，200 μg≈1 800 U);SonoVue 超声微泡造影剂由Bracco 生产，微囊为磷脂成分，内包裹六氟化硫气体，90%微泡直径＜6 μm，平均直径约2. 5 μm;链脲佐菌素购自BBI，上海生工生物有限公司分装，注射前用0. 1 mol/L、pH 值4.0 ～4.4 的柠檬酸缓冲液配制;兔抗鼠CD31 Ⅰ抗购自上海生工生物有限公司;改良Masson 三色染色液购自武汉谷歌生物科技有限公司;TUNEL 染色试剂盒为In situ Apoptosis Detection Kit (DMK500)，购自TaKaRa。实验仪器为Siemens公司Acuson Sequoia 512C 彩色多普勒超声诊断系统，15L8w-S 线阵探头，探头频率为12 ～14 MHz;动物呼吸机型号为HX-300，购自成都泰盟科技有限公司。

3 主要方法

3.1 动物造模及分组 所有大鼠适应性喂养7 d后，随机挑选28 只腹腔注射1%链脲佐菌素溶液70 mg/kg 体质量，注射后第1 天、第3 天及第7 天取尾静脉血测定血糖浓度，血糖值＞16.7 mmol/L 且尿量和饮水量明显增多者继续饲养至第8 周，进行超声心动图检测，出现心功能异常者纳入DCM 模型组(24 只大鼠成模;4 只未成模而剔除)。其余12 只作为正常对照组，腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。

3.2 携载aFGF 微泡造影剂( SonoVue-aFGF) 制备

临用前将7 mg aFGF 冻干粉与5 mL 生理盐水混合，轻度振摇充分溶解后形成aFGF 溶液，再加入到SonoVue 瓶中，于室温下静置10 ～20 min 进行孵育，期间轻柔振荡数次，形成SonoVue-aFGF 溶液。

3.3 实验处理 24 只DCM 大鼠随机平均分成DCM 组和aFGF 治疗组。aFGF 治疗组大鼠充分麻醉后，将探头置于大鼠心前区，取乳头肌水平左室短轴观，聚焦深度3.5 ～4.0 cm，经尾静脉注射携aFGF微泡造影剂0.1 mL，当心肌内见大量微泡充盈时即用机器自带MBD 功能反复多次击破微泡(机械指数MI=1.9)，直至微泡完全消失，见图1。正常对照组与DCM 组不做任何处理。于第2 天重复上述给药处理1 次。随后所有大鼠再饲养4 周(饲养过程中DCM 组死亡2 只)。干预后4 周，所有实验大鼠充分麻醉，切开大鼠颈前区皮肤，分离气管，接动物呼吸机，打开大鼠胸腔，将心导管从心尖直接刺入大鼠左心室内，Chart 5 for Windows 软件同步记录左室收缩末压力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒张末压力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左室内压最大上升及下降速率(maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，LV ± dp/dtmax)。实验结束时处死大鼠，取心脏，行CD31 免疫组织化学染色、改良型Masson 胶原染色和TUNEL 染色。

Figure 1. The process of ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD).A:the left ventricular myocardium was filled with contrast agents;B:targeted break;C:the microbubbles were cracked by UTMD.图1 超声靶向微泡击破过程

3.4 CD31 免疫组织化学染色 采用Polymer 法对心肌组织石蜡切片进行CD31 免疫组化染色，严格按照试剂盒说明书进行。封片后在显微镜下观察，微血管被染成棕褐色。每组取12 张切片，每张切片随机取20 个400 倍视野计算微血管数量，取其均值，作为心肌组织微血管密度(microvessel density，MVD;个/高倍视野)。

3.5 改良型Masson 胶原染色及心肌胶原容积分数( collagen volume fraction，CVF) 测量 心肌组织石蜡切片脱水后严格按照试剂盒说明书进行。封片后在显微镜下观察，胶原纤维呈蓝色，心肌纤维及红细胞呈红色。随后应用Image-Pro Plus 6.0 软件分析测量心肌CVF:每组取12 张切片，每张切片随机取20 个200 倍视野，CVF(%)=胶原面积/总面积×100%，取其均值。

3.6 TUNEL 法检测心肌组织细胞凋亡指数( apoptotic index，AI) 心肌组织石蜡切片脱水后严格按照试剂盒说明书进行。结果判断:阳性细胞核呈棕色，阴性细胞核呈蓝色，红细胞呈透明无核黄色。每组取12 张切片，每张切片随机取20 个400 倍视野，计数该视野细胞中染色阳性的细胞数，AI(%)=视野内的阳性细胞数/视野内总的细胞数×100%。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，若有差别，用LSD 检验进行两两比较。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠左心室血流动力学指标的改变

干预后4 周，DCM 组大鼠LVESP 和LV ± dp/dtmax与正常对照组相比分别减低29%、31%和32%(P ＜0.01)，LVEDP 则较正常对照组增高37%(P ＜0.01)，说明DCM 组大鼠左心室舒缩功能已经出现明显损害;而aFGF 治疗组大鼠LVESP 和LV ±dp/dtmax与DCM 组相比分别增高20%、35% 和29%(P ＜0.01)，LVEDP 较DCM 组 减 低18% (P ＜0.01)，表明超声微泡靶向递送aFGF 后，大鼠左心室舒缩功能有所好转，aFGF 干预可以有效改善DCM大鼠的左心室舒缩功能，见表1。

表1 左心室血流动力学指标的改变Table 1. Changes of left ventricular hemodynamic parameters(Mean±SD)

2 各组大鼠心肌MVD 改变

干预4 周后，CD31 免疫组织化学染色显示，正常对照组大鼠心肌内有较多微血管且排列整齐;DCM 组大鼠心肌内微血管明显减少、稀疏;aFGF 治疗组大鼠心肌内微血管数量较DCM 组大鼠明显增多。DCM 组大鼠MVD 比正常对照组低58%(P ＜0.01)，aFGF 治疗组大鼠则较DCM 对照组增加64%(P ＜0.01)，表明超声微泡靶向递送aFGF 后明显增加DCM 大鼠心肌微血管，见图2、表2。

Figure 2. The expresults of CD31 in rat myocardium in the three groups examined by immunohistochemical staining (×400).A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.图2 免疫组化染色检测3 组大鼠心肌组织CD31 表达

表2 心肌微血管密度、胶原容积分数及凋亡指数Table 2. Results of microvessel density (MVD)，collagen volume fraction (CVF)and apoptotic index (AI)in rat myocardium(Mean±SD)

3 各组大鼠心肌CVF 改变

干预后4 周，改良型Masson 胶原染色观察显示，正常组大鼠心肌内胶原含量较少，主要以心肌纤维、纤维素等为主;DCM 组大鼠心肌内胶原大量增生，几乎充满整个视野区;而aFGF 治疗组大鼠心肌内胶原含量明显减少。DCM 组大鼠CVF 比正常对照组增高67%(P ＜0.01)，aFGF 治疗组大鼠则较DCM 对照组减低24%(P ＜0.01)，表明超声微泡靶向递送aFGF后明显降低DCM 大鼠心肌胶原含量，见图3、表2。

Figure 3. The expression of collagen in rat myocardium in the three groups detected by improved Masson staining (×200).A:control group;B:DCM group:C:aFGF treatment group.图3 3 组大鼠心肌胶原染色结果

4 各组大鼠心肌组织AI 改变

干预后4 周，TUNEL 法染色结果显示，正常组大鼠心肌内仅有少数细胞发生凋亡，而DCM 大鼠心肌内出现大量心肌细胞凋亡现象，aFGF 治疗组大鼠心肌细胞凋亡则明显减少。DCM 组大鼠AI 比正常对照组增高291%(P ＜0.01)，aFGF 治疗组大鼠则较DCM 对照组减低49%(P ＜0.01)，表明超声微泡靶向递送aFGF 后具有明显抗DCM 心肌细胞凋亡的作用，见图4、表2。

Figure 4. Apoptosis of myocardial cells of rats in the three groups staining detected by TUNEL (×400). A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.图4 TUNEL 法3 组大鼠检测心肌细胞凋亡

讨 论

aFGF 是成纤维细胞生长因子家族成员之一，在促进细胞生长、组织形成、诱导血管新生等方面具有重要的作用。aFGF 对缺血心肌的促微血管再生作用由Banai 等于1991 年首先开始研究，已经证实aFGF 具有促进心肌微血管新生、降解心肌胶原、扩张血管、缺血保护、神经营养等生物学效应［4］。此外，李彦等［5-6］与Palmen 等［7］的研究均发现，aFGF 还具有显著降低缺血心肌细胞凋亡率，提高心肌抗氧化的能力。DCM 是指糖尿病导致的特异性心肌病变，其确切发病机制至今尚未完全明了。已有的研究表明，DCM 的始动因素为心肌能量代谢异常、氧化应激、心肌微血管病变、心肌间质纤维化等多因素共同促进DCM 的病理发展。其中微血管病变与心肌间质纤维化为DCM 的特征性改变，氧化应激在DCM的病程演进中扮演着重要的角色。氧化应激一方面可损伤DNA 和线粒体膜，释放线粒体中的凋亡活性物质，启动细胞凋亡程序，增加心肌组织细胞凋亡率［8-9］;另一方面促进晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的增多。AGEs 增多可破坏心肌胶原生成与降解之间的平衡，导致心肌间质纤维化，加重心肌僵硬度，影响心肌舒缩功能［10］，同时，AGEs 增多聚集可使心肌微血管基底膜增厚、管腔横截面积减小、微血管密度减低，导致心肌微循环障碍、心肌细胞缺血损伤和坏死。因此，aFGF 对于DCM 的治疗应该具有重要的价值。然而，由于缺乏合适的递送载体，目前aFGF 的体内应用仍局限于采用直接心肌、静脉或腹腔注射方式的动物实验研究，迄今尚无aFGF 用于治疗糖尿病心肌病的报道。实现aFGF 的靶向递送使其发挥相应的生物学效应，关键在于构建一种高效、安全的递送载体。

近年来大量研究表明，超声微泡可以携带各种药物/基因，利用微泡被超声能量靶向击破时产生的空化效应和声孔效应，递送药物/基因进入靶细胞或靶组织，达到治疗目的［11-12］，与质粒和腺病毒载体相比，既提高了递送效率，又不会产生以腺病毒为载体时引起的免疫反应。国内王潇等［13］已应用SonoVue剂介导Ang-1 基因靶向治疗心肌梗死，证实该方法可有效改善心肌梗死动物左室心肌功能。因此以超声微泡作为aFGF 的心肌靶向递送载体，克服了aFGF直接心肌注射存在有创性和操作复杂性等问题，同时实现aFGF 的靶向、高效、安全递送。目前Zhao等［14］已经应用携载aFGF 的微泡治疗心肌梗死，证实携载aFGF 的微泡可有效改善心肌梗死动物的心功能。

本研究构建携载aFGF 的SonoVue 微泡，以超声靶向微泡击破技术作为递送手段，利用超声能量使微泡在心肌组织靶向破裂，从而将aFGF 定向释放并发挥作用，干预后4 周应用心导管检测心功能变化，观察发现aFGF 治疗组大鼠左心室各项收缩功能指标均较DCM 组明显改善。CD31 免疫组织化学染色、改良型Masson 胶原染色及TUNEL 法检测AI 的结果亦证实，aFGF 治疗组心肌微血管数量较DCM组明显增多，胶原含量较DCM 组明显减少，细胞凋亡较DCM 组明显减轻。分析其原因，微泡被超声能量靶向击破时产生的空化效应可以在其周围形成高能环境［11］，随后形成作用于内皮细胞膜与毛细血管上的冲击波，冲击波产生的切应力可以使膜上出现暂时性开放小孔即声孔效应［15］，从而导致细胞膜通透性增加，使较多的aFGF 通过开放小孔进入心肌组织而发挥其促血管新生、降解胶原及抗氧化的生物学功能，逐渐改善心肌微循环，减轻心肌间质纤维化，减少细胞凋亡，改善心功能。

综上所述，超声微泡靶向递送aFGF 至心肌组织，可有效改善DCM 大鼠左室舒缩功能，有望成为今后DCM 治疗的新策略，应用前景广阔。本研究存在一些局限性，比如aFGF 是多种类型细胞的促有丝分裂原，其多效性有可能引起治疗目的之外的细胞和组织生长，从而产生副作用;而且本研究对DCM大鼠治疗的疗效受超声能量、造影剂的数量、微泡自身特性等因素的影响。因此，今后应进一步深入研究和优化该治疗方法的载药微泡浓度、应用剂量和时机以及超声靶向爆破时机械指数等参数的设置，以能取得满意的治疗效果。

［1］ Boudina S，Abel ED. Diabetic cardiomyopathy revisited［J］. Circulation，2007，115(25):3213-3223.

［2］ Li XK，Lin ZF，Li Y，et al. Cardiovascular protection of nonmitogenic human acidic fibroblast growth factor from oxidative damage in vitro and in vivo［J］. Cardiovasc Pathol，2007，16(2):85-91.

［3］ Geist A，Marx J，Müller S，et al. Combination of enoxaparin and fibroblast growth factor-1 increases myocardial blood flow and capillary density after myocardial infarction in rabbits［J］. Eur Surg Res，2005，37(4):191-198.

［4］ 靳 波，徐盈斌，刘旭盛. 酸性成纤维细胞生长因子生物学特性及其应用研究进展［J/CD］. 中华损伤与修复杂志(电子版)，2010，5(1):117-121.

［5］ 李 彦，王永玲，李校堃，等.改构型酸性成纤维细胞生长因子抑制新生大鼠心肌缺氧/复氧模型细胞的凋亡［J］.中国组织工程研究，2012，16(20):3703-3706.

［6］ 李 彦，李 菁，李校堃，等.改构型酸性成纤维细胞生长因子对离体大鼠缺氧再灌注心脏的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2005，21(5):855-858.

［7］ Palmen M，Deamen MJ，Leon J，et al. Fibroblast growth factor-1 improves cardiac function recovery and enhances cell survival after ischemia and reperfusion:a fibroblast growth factor receptor，protein kinase C，and tyrosine kinase-dependent mechanism［J］.Am Coll Cardi，2004，44(5):1113-1123.

［8］ Tsutsui H，Ide T，Kinugawa S. Mitochondrial oxidative stress，DNA damage，and heart failure［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8(9-10):1737-1744.

［9］ 徐利芬，陈 佳.糖尿病心肌病与心肌细胞凋亡的研究进展［J］.中华老年医学杂志，2010，29(1):82-84.

［10］Murarka S，Movahed MR. Diabetic cardiomyopathy［J］. J Card Fail，2010，16(12):971-979.

［11］Geis NA，Katus HA，Bekeredjian R. Microbubbles as a vehicle for gene and drug delivery:current clinical implications and future perspectives［J］. Curr Pharma Des，2012，18(15):2166-2183.

［12］王 逵，杨成明，刘国通，等.超声微泡介导转染FK12.6 结合蛋白基因对心力衰竭犬心功能的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(4):683-687.

［13］王 潇，周 青，陈 茜，等.超声破坏SonoVue 微泡介导Ang-1 基因的体外体内转染［J］.中华超声影像学杂志，2012，21(1):65-70.

［14］Zhao YZ，Lu CT，Li XK，et al. Improving the cardio protective effect of aFGF in ischemic myocardium with ultrasound-mediated cavitation of heparin modified microbubbles:preliminary experiment［J］. J Drug Target，2012，20(7):623-631.

［15］ Ashokkumar M.The characterization of acoustic cavitation bubbles:an overview［J］. Ultrason Sonochem，2011，18(4):864-872.