蛋白激酶A 在慢性心房颤动患者2 型小电导钙激活钾通道调控中的作用*

张 丽， 李 涛， 李妙龄， 毛 亮， 谭晓秋， 杨 艳， 曾晓荣

(医学电生理省部共建教育部重点实验室，泸州医学院心血管医学研究所，四川 泸州646000)

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是最常见且并发症严重的心律失常之一。心房电重塑理论是近年来房颤机理研究中的核心内容［1］。而动作电位时程则由心肌不同离子通道活动决定，因此研究AF 时离子通道的改变对AF 机制的阐明有重要意义。

小电导钙激活钾通道(主要为SK2 亚型)在心房表达丰富。文献报道，AF 患者心房肌细胞内钙浓度升高［2］，且SK2 通道功能改变与AF 的发生和维持有关［3］;另一方面，SK2 通道钙离子敏感性增加。此外，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)参与了AF 时胞内钙循环紊乱的病理过程，且其对SK2 通道的调节作用在表达细胞和神经系统得到充分证明［4-6］。因此，我们推测AF 时胞内钙超载可能影响SK2 通道功能，且PKA 通过一定途径调节SK2 通道的活动。本文以人心房肌细胞为研究对象，就AF 时SK2 通道功能的改变及PKA 相关途径对SK2 通道的调控机制进行了研究，旨在从细胞水平探讨PKA 是否通过影响SK2 通道功能参与AF 电重构过程。

材 料 和 方 法

1 标本来源

采用泸州医学院附属医院2011 年9 月至2012年9 月心胸外科行体外循环手术常规切除的患者右心耳组织为研究对象，其中窦性心律(sinus rhythm，SR)者作为对照组。本实验得到泸州医学院伦理委员会的批准，所有试验程序遵照国内的相关法规和政策。患者的病例资料见表1。

2 试剂和药品

V 型胶原酶、XXIV 型蛋白酶、白蛋白、HEPES、EGTA、牛磺酸、腺苷、甘露醇、N-甲基谷氨酸(Nmethylglutamate，NMG)、β-羟丁酸、蜂毒明肽、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和N-［2-(p-bromocinnamylamino)ethyl］-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate(H-89)均购自Sigma，其它试剂均为国产分析纯。

3 主要方法

3.1 人体心房肌细胞的分离 人心肌细胞急性酶分离采用改良的两步法［7］。将心脏外科手术中切除的右心耳组织置于预先氧饱和的、冰冻的Cardiplegic液中，快速送往实验室。首先将组织块置于酶Ⅰ(蛋白酶1.22 ×104U/L，胶原酶1.5 ×105U/L，白蛋白1 g/L)中进行消化，于37 ℃恒温水浴箱中持续充氧消化至镜下可见一个完整心肌细胞，再将消化后的心耳组织置于酶Ⅱ(胶原酶1.5 ×105U/L，白蛋白1 g/L)于37 ℃恒温水浴箱中持续充氧消化5 ～10 min，收集消化后的细胞悬液进行离心2 min (500 r/min)，弃上清液，KB 液保存细胞，置于4 ℃冰箱中备用，1 h 后用于电生理实验。

表1 SR 组和AF 组患者临床基本资料Table 1. The clinical characteristics of the patients in SR and AF groups (Mean±SD)

3.2 电生理实验 显微镜下选择呈杆状、横纹清楚的细胞进行电生理实验。浴液(mmol/L):NMG 140，KCl 4，MgCl21，葡萄糖5，HEPES 10，pH 7.4)。实验电极采用硬质玻璃管，经水平拉制机(P-97，Sutter)经3 步拉制而成，电极尖端直径为1 ～2 μm，充灌电极液(mmol/L:葡萄糖酸钾144，MgCl21.15，EGTA 5，HEPES 10，游离钙离子浓度为500 nmol/L，pH 7.4)后，电极阻抗约2 ～4 MΩ。实验记录采用EPC10 放大器、数模/模数转换器和Patch-Master 进行通道电流的采集。实验用常规膜片钳全细胞记录中的电压钳模式，采样频率20 kHz，低通滤波2 kHz，串联电阻补偿70% ～80%。高阻抗封接形成后阻抗达1 ～10 GΩ 时，在给予短促负压吸破细胞膜，形成全细胞模式后可进行通道电流的记录。刺激方案为:保持电位-60 mV，测试电压从-130 mV到+60 mV，脉冲阶跃为+10 mV，钳制时间为200 ms ，见图1A。膜片钳实验均在室温下进行。

3.3 总蛋白及PKA 浓度测定 总蛋白浓度测定采用BCA 法。PKA 浓度的测定采用ELISA，人PKA ELISA 试剂盒购自RB(分装)，检测仪器采用Infinite M200 酶标仪(Tecan)。样品准备方法为:将心脏外科手术中切除的心耳组织置于预先氧饱和的冰冻Cardiplegic 液中，快速送往实验室。在冰上用PBS液清洗心耳组织，称重，加入适量PBS(1 mg 组织+1 000 μL PBS +1 μL PMSF)，匀浆器将标本匀浆。4 ℃离心20 min (2 000 ～3 000 r/min)，取上清获得组织总蛋白。PKA 的蛋白检测严格按照ELISA 说明书进行操作。

4 统计学处理

电生理数据采用Clampfit 10. 0 软件(Axon Instruments)和Origin 8.0 软件进行统计学分析作图，数据以均数±标准差(mean ±SD)表示。组内处理前后比较采用配对t 检验，组间比较采用独立样本t检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 AF 时SK2 通道功能的改变

1.1 SR 组SK2 通道电流的特性 保持电位-60 mV，测试电压从-130 mV 到+60 mV (10 mV 阶跃)，记录SR 组心房肌细胞的混合电流(图1B);加入SK2 通道特异性阻断剂蜂毒明肽(apamin;0. 1 μmol/L)后以同样方法记录电流(图1C);相同测试电压下，蜂毒明肽加入前后电流相减获得蜂毒明肽敏感的电流，即SK2 通道电流(图1D)。为排除细胞大小差异的影响，SK2 通道电流以电流密度(pA/pF)表示。该方法记录的SR 组SK2 通道电流的电流-电压关系呈现内向整流特性(图2A)。

Figure 1. The original recording of SK2 channel currents in SR (B ～D)and AF (E ～G)groups. A:the stimulation protocol of SK2 channel current recording;B，E:representative integrated inward currents obtained in human atrial myocytes before apamin treatment;C，F:representative integrated inward currents obtained in human atrial myocytes after apamin (0.1 μmol/L)treatment;D，G:the apamin-sensitive SK2 channel currents in human atrial myocytes were obtained by digital subtraction.图1 SR 组和AF 组SK2 通道电流记录

1.2 AF 组SK2 通道电流的特性 同样的方法记录AF 组心房肌细胞SK2 通道电流(图1E ～G)。记录的AF 组SK2 通道电流的电流-电压关系呈现内向整流特性(图2A)。本实验记录到的SR 组和AF 组SK2 通道电流特性与文献报道一致。

1.3 AF 组SK2 通道功能改变 与SR 组相比，AF组心房肌细胞SK2 通道电流密度增大，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 测试电压下，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图2A。在-130 mV 钳制电压下，SR 组和AF 组SK2通道电流密度分别为(-2. 61 ± 0. 14)pA/pF 和(-6.21 ±0.59)pA/pF(P ＜0.05)。这表明AF 发生后，SK2 通道电流明显增强，这与本研究室之前的报道一致［8］。与SR 组相比，AF 组SK2 通道电流在混合电流中比例增加，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 测试电压下，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图2B。在-130 mV钳制电压下，SR 组和AF 组SK2 通道电流占混合电流的比例分别为(20. 01 ± 1. 44)% 和(42. 87 ±1.79)%(P ＜0.05)。

2 PKA 选择性抑制剂H-89 对SR 组和AF 组SK2通道功能的调节

2.1 H-89 对SR 组SK2 通道电流的调节 参照文献，浴液中加入10 μmol/L H-89［9］，观察药物对电流的作用，继续在浴液中加入蜂毒明肽。在相同测试电压下，H-89 作用后的混合电流与加入蜂毒明肽后的混合电流相减，即为H-89 作用后的SK2 通道电流。经统计分析，浴液中加入H-89 后，SR 组心房肌细胞SK2 通道电流密度减小，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV 和-90 mV 下电流密度减小的差异有统计学意义(P ＜0. 05)，见图3A。在-130 mV钳制电压下，H-89 对SR 组SK2 通道电流的抑制率为(39.27 ±4.08)%。

2.2 H-89 对AF 组SK2 通道电流的调节 同样的方法观察H-89 作用后AF 组SK2 通道电流。浴液中加入H-89(10 μmol/L)后，AF 组心房肌细胞SK2 通道电流密度减小，在- 130 mV、- 120 mV、- 110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 电压下，电流密度减小的差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图3B。在-130 mV 钳制电压下，H-89 对AF 组SK2 通道电流的抑制比为(76.32 ±2.94)%。

Figure 2. The alteration of SK2 channel currents in SR and AF groups. A:current densities of SK2 channel currents at different stimulating voltages;B:proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents.Mean±SD. * P ＜0.05 vs SR group.图2 SR 组和AF 组SK2 通道电流的电流密度及在混合电流中的比例

2.3 H-89 对SR 组和AF 组SK2 通道电流调控的比较 与SR 组相比，H-89 对AF 组心房肌细胞SK2 通道电流密度的抑制率增大，在-130 mV、-110 mV、-100 mV 和- 90 mV 电压下差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图4A。在-130 mV 钳制电压下，H-89 使SR 组和AF 组SK2 通道电流在混合电流中比例下降(P ＜0.05)，见图4B;抑制率分别为(37.48 ±4.77)%和(56.40 ±3.66)%(P ＜0.05)，见图4C。以上结果提示，PKA 选择性抑制剂H-89 能够调节SR 组和AF 组SK2 通道功能，且对AF 组SK2 通道功能调节作用更大。

3 PKA 对SK2 通道调控在AF 中作用

AF 组加入H-89 后与SR 组不加H-89 相比，SK2通道电流在混合电流中的比例差异无统计学意义，见图5，提示H-89 可以使蜂毒明肽敏感电流成分在房颤时的高水平恢复到窦性心律时的水平。

Figure 3. Effects of PKA-selective inhibitor H-89 on SK2 channel currents in SR (A;n=6)and AF (B;n=5)groups. Mean±SD.* P ＜0.05 vs without H-89.图3 H-89 对SR 组和AF 组SK2 通道电流的影响

Figure 4. Comparison of the regulatory effect of H-89 on SK2 channel currents in SR and AF groups. A:inhibitory rates of SK2 channel current densities by H-89;B:proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents at -130 mV with or without H-89 treatment;C:inhibitory rates of proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents at -130 mV by H-89. Mean±SD. * P ＜0.05 vs SR group;#P ＜0.05 vs without H-89.图4 H-89 对SR 组和AF 组SK2 通道电流调控的比较

Figure 5. The proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents in AF group with H-89 (n=5)and SR group without H-89 (n=5).Mean±SD.图5 AF 组加入H-89 后与SR 组不加H-89 时SK2 通道电流占混合电流比例的比较

4 PKA 含量变化

心房组织PKA 浓度测定和总蛋白浓度测定的标准曲线R2＞0.99，线性关系好。AF 组的PKA 浓度与SR 组相比明显下降，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

表2 SR 组和AF 组心房组织总蛋白和PKA 浓度Table 2. Levels of total protein and PKA in SR and AF atrial tissues (Mean±SD)

讨 论

AF 是一种复杂的离子活动变化导致的功能性紊乱，其中胞内钙紊乱是导致房性心律失常的重要因素。心肌细胞在复极过程中对钙特别敏感，因此受钙调控的离子通道将明显影响动作电位复极的变化。SK2 通道是钙激活钾通道在心房中的主要亚型，对胞内钙异常敏感(Kd＜0.5 μmol/L)，胞内钙轻微变化都对其功能产生明显影响，且该通道主要在心房组织表达，因此成为目前AF 研究的热点。

SK2 通道电流主要在心肌细胞复极末期发挥作用:SK2 通道特异性阻断剂蜂毒明肽可导致心肌细胞动作电位末期明显延长，且蜂毒明肽敏感的电流成分所起作用与动作电位期间胞内Ca2+浓度的变化相平行，表明SK2 通道在人心肌细胞动作电位的复极期发挥着重要作用，且参与细胞内钙调控。Lu等［10］研究发现心肌细胞SK2 通道与L 型钙通道(Ltype calcium channel，LTCC)通过α-肌动蛋白2 偶联，LTCC 基因敲除的小鼠心房肌细胞SK2 通道蛋白表达降低，进一步证实SK2 通道的生理功能与胞内钙活动有关。

本实验结果结合相关研究表明，在SR 组，SK2通道对维持心房正常电兴奋发挥重要作用;本实验显示AF 时SK2 通道功能增强，细胞膜上的通道电流密度及在混合电流中成分增加。AF 时，SK2 通道电流增加可能与胞内钙超载有关。AF 疾病状态下，心房电活动频率增高引起大量钙内流，同时心房肌舒张期缩短引发钙渗漏，肌浆网钙储备耗竭［11］，钙不能充分从细胞内移出及肌浆网Ca2+-ATP 酶对钙离子摄取障碍［12］，导致胞内钙循环紊乱，发生钙超载，从而激活SK2 通道。AF 时SK2 通道电流密度和在混合电流中比例增大，符合房颤的电重构“AF begs AF”假说，即AF 的反复发作或连续电刺激导致心房肌有效不应期进行性缩短、离散度增加、频率适应性下降、消失或者反向变化等。AF 时SK2 通道电流明显增加，加速动作电位末期的复极，使动作电位时程缩短，参与细胞电重构过程。外向K+电流的增多是导致动作电位缩短的重要机制，因此抑制SK2 通道电流的增加将减少房性快速性心律失常的发生。Diness 等［3］利用大鼠、狗和家兔的心脏在体及离体实验证明了此观点:应用SK 通道特异性抑制剂UCL1684、ICA 和NS8593 可抑制SK 通道，延长心肌细胞的有效不应期，但不影响QT 间期，可预防和终止AF 的发生。

此外，关于心肌细胞SK2 通道电流在AF 中的作用也有一些不同的观点。有人认为SK2 通道电流密度及在混合电流中比例增加使动作电位复极加速，导致通道对K+通透性增加，K+外流增多，并在动作电位后引起后超极化，可以抑制动作电位的反复兴奋，对维持细胞的正常生理功能具有重要作用。2009 年，Li 等［13］在完全敲除SK2 基因的小鼠模型上发现，心房肌细胞的动作电位时程明显延长，特别是动作电位的末期延长，而动作电位的末期对异常兴奋极其敏感，末期延长容易诱发触发活动，导致AF的发生。此实验的研究结果与经典的AF 发生机制有悖，这可能是由于在生理状态下，SK2 通道在动作电位复极后期发挥重要作用，而动作电位复极后期易于发生异常兴奋所致。研究结果提示我们，SK2在心房肌上具有两重作用:过分抑制能产生动作电位末期明显延长而发生后除极电位，导致AF 的发生;过分上调使动作电位缩短，易产生折返，也能促成房性心律失常。本实验中PKA 选择性抑制剂H-89 使蜂毒明肽敏感电流在AF 时的高水平几乎恢复到窦性心律时的水平，但H-89 同时也对SR 组蜂毒明肽敏感电流有明显抑制作用，因此我们应对SK2通道适度调控，才能真正使AF 得到有效的治疗，从而减少副作用。

cAMP/PKA 信号系统是许多离子通道或转运体信号通路调节的重要机制和环节。H-89 是PKA 选择性抑制剂，广泛应用于PKA 信号系统对通道调节的研究。在心肌细胞中PKA 能够通过磷酸化多种通道蛋白，包括LTCC、兰诺定受体2 (ryanodine receptor 2，RyR2)、肌钙蛋白I、肌球蛋白连接蛋白C 以及受磷蛋白(phospholamban，PLN)，参与心肌钙循环的调控，维持心肌细胞正常生理功能。

心房肌细胞胞内钙超载是多种因素共同作用的结果。本实验分别检测SR 组和AF 组总蛋白和PKA 的浓度，结果显示AF 时总蛋白浓度未发生明显变化，但是PKA 的浓度是降低的，提示PKA 参与了AF 胞内钙循环紊乱的病理变化。PKA 参与AF 时胞内钙超载的发生，与多个通道及蛋白的异常活动有关。Ramadan 等［14］研究表明AF 患者的心肌细胞内，PKA 激活后通过磷酸化心肌细胞膜LTCC 通道活动增强，增加收缩期心肌细胞的钙内流，在AF 发生和维持中起重要作用。Vest 等［15］首次应用犬快速起搏AF 模型及AF 患者的心房组织研究了RyR2 过度磷酸化在AF 发病机制中的作用，在起搏诱导的犬AF 模型中，PKA 介导的RyR2 过度磷酸化明显增加，与RyR2 结合的FK506 结合蛋白12.6(FK506-binding protein 12.6，FKBP12.6)数量明显减少，同时AF心肌细胞舒张期RyR2 的平均开放几率明显增加，开放时间延长，应用RyR2 稳定剂JTV-519 能够促进AF 组FKBP12.6 与过度磷酸化的RyR2 结合，从而降低RyR2 的平均开放几率;对慢性AF 患者心房组织的研究也得到了相似的结果。因此PKA 介导的RyR2 过度磷酸化所导致的肌浆网Ca2+渗漏可能与AF 的发生和维持有关。在人心肌细胞中，PKA 可导致RyR2 磷酸化，从而使FKBP12.6 与RyR2 发生分离，导致其开放概率和RyR2 对Ca2+的敏感性增加，进而导致肌浆网Ca2+储备耗竭和舒张期Ca2+渗漏。此外，PKA 对PLN 磷酸化调节作用的异常，也参与了AF 时肌浆网钙泄漏及胞内钙超载的发生［16］。AF 时胞内钙超载的发生是多因素共同作用的结果，PKA参与AF 时胞内钙超载的病理生理过程还可能与cAMP 改变有关，需进一步探索。

本实验结果显示，AF 时PKA 对SK2 通道功能发挥更大的调节作用，但在AF 的心房组织中PKA含量下降。结合文献报道分析PKA 对AF 时心房肌细胞SK2 通道功能调控较强的原因:其一，PKA 直接作用于SK2 通道的功能亚基，调节通道对胞内钙离子的敏感性，从而调节其在心肌细胞中的生理功能。SK2 通道上存在多个PKA 磷酸化位点:位于胞内N-端的Ser136和位 于C 端 的Ser465、Ser568、Ser569和Ser570。AF 时，PKA 增加SK2 通道对胞内钙离子的敏感性，从而使SK2 通道活动增加，电流增强。因而实验结果表现为PKA 抑制剂H-89 对AF 组SK2 通道电流影响较大。其二，AF 时心房肌细胞内PKA 活性发生变化，导致AF 时对SK2 通道磷酸化作用发生改变，影响SK2 通道生理功能。其三，PKA 通过磷酸化与胞内钙循环相关的通道蛋白，导致胞内钙超载，从而间接增加钙高度敏感的SK2 通道的开放概率，使AF 时SK2 通道电流上调。因此抑制PKA 对AF时相关通道蛋白有更明显的影响，从而更明显地抑制AF 时的SK2 电流。

本研究为探索AF 的机制及临床治疗提供了新的实验依据。进一步研究PKA 的活性及其对心房肌细胞SK2 通道的磷酸化调控，可以深入了解PKA 在SK 通道调控及其在AF 发生机制中的作用。根据这些实验结果，在后期研究中可将SK2 通道作为靶点筛选特异性作用于心房的药物或基因治疗的方法，维持SK2 通道的正常功能，为房性快速性心律失常的治疗开辟新的途径。

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