重组核苷磷酸转移酶产生菌培养条件优化

何宝龙，孙丽慧，郑裕国

（浙江工业大学 生环学院，浙江 杭州 310014）

5′-肌苷酸（Inosine-5′-monophosphate 即 5′-IMP）是核苷的磷酸酯类物质，由碱基、核糖和磷酸组成。主要以二钠盐的形式作为食品增鲜剂，具有比谷氨酸钠（味精）更鲜美的增鲜效应；也可与味精混合使用，且具有相乘的协同效应；其对甜味和肉味也有增效作用，对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工业生产中越来越受到重视和欢迎[1-3]。同时，由于磷酸转移酶法合成5′-IMP具有选择性高和反应条件温和等优点，因而以肌苷为原料，通过磷酸转移酶法合成5′-IMP已成为当前研究的热点[4,5]。

本实验室前期成功构建了携带有来自Escherichia blattae磷酸转移酶（AP/PTase）编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT，可以高选择性地使肌苷5’-位羟基磷酸酯化[6]。然而，在生物催化技术的开发过程中，关键在于如何有效提高生物催化剂的活力[7-9]。因此，必须对微生物的产酶条件进行优化，提高单位体积发酵液的酶活单位。本实验以获得高产重组核苷磷酸转移酶为目标，优化产酶培养基的组成，为生物催化合成呈味核苷酸的工业化生产奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT，本实验前期构建。

1.2 培养基

种子培养基和基础发酵培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0灭菌后补加终浓度为50 μg/mL卡那霉素。

1.3 培养方法

种子培养：挑取一环4℃保存的斜面菌种接入含50 mL种子液培养基的250 mL三角瓶中，于37℃，150 r/min条件下培养10 h。

发酵培养：将培养好的种子液按4%接种量，转接到装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃，150 r/min培养至 OD600达到 0.6～0.8，加入0.1 mmol IPTG，28℃继续培养10 h。发酵结束后，离心收集菌体。

1.4 静息细胞转化

取35 mL发酵液，离心收集菌体，生理盐水(0.85%)洗涤2次，悬浮于10 mL醋酸钠缓冲液(100 mmol，pH 4.0)中，同时加入1%底物肌苷及20%焦磷酸钠，35℃,150 r/min反应1 h。取样1 mL，加入 200 μL 2 mol HCl终止反应。离心后，取上清液检测产物含量，每个样品3次平行。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的测定

采用细胞干重法。

1.5.2 产物5′-肌苷酸分析方法

取一定体积的转化液12 000×g离心5 min，利用高效液相色谱分析检测5′-肌苷酸。色谱条件如下：色谱柱为 C18 硅胶柱（250 mm×4.6 mm）；流动相组成为10 mmol磷酸钾：甲醇 为9：1；柱温为室温；检测波长为245 nm；流动相流速为1 mL/min。

1.5.3 磷酸转移酶酶活定义

酶活单位（U）定义为：在35℃,pH 4.0条件下，在1 min内催化肌苷生成1 μmol 5’-肌苷酸所需要的酶量定义为1 U。

2 结果与讨论

2.1 培养基组成对菌体生长和产酶的影响

2.1.1 甘油浓度对菌体生长和产酶的影响

实验室前期实验表明在基础培养基中添加甘油有利于菌体生长和产酶，因此本实验首先考察了甘油浓度对重组大肠杆菌的生长以及产磷酸转移酶的影响。由图1可见，当甘油添加量为7.5 g/L时，酶活及生物量都相对较高，分别达到123.4 U/L和3.13 g/L，当甘油浓度提高到20 g/L时，其酶活和生物量分别为78.6 U/L和3.48 g/L，相对甘油浓度为7.5 g/L时生物量有所增加但酶活有明显的降低，因此，综合产酶及生物量考虑，最终确定甘油的最佳浓度为7.5 g/L。

图1 甘油浓度对菌体生长以及产酶的影响

2.1.2 氮源对菌体生长和产酶的影响

蛋白胨和酵母粉作为有机氮源，其浓度对菌体生长和产酶影响很大，本实验分别对这两种有机氮源的浓度进行了考察，结果分别如图2和图3。由图2可见，蛋白胨浓度从5 g/L上升到12.5g/L，菌体的酶活、生物量菌也随之升高，当蛋白胨浓度为12.5 g/L时，菌体酶活达到最高，为125.6 U/L，此时生物量为3.2 g/L。蛋白胨浓度继续提高，酶活呈下降趋势，生物量继续升高但趋势微弱。最终确定蛋白胨的最佳浓度为12.5 g/L。

图2 蛋白胨浓度对菌体生长及产酶的影响

从图3可以看出，在较低浓度范围内，随着酵母粉浓度的身高，酶活不断上升，在10 g/L时达到最大值130.8 U/L，而生物量随着酵母粉浓度的升高一直增大，故综合酶活和生物量考虑，选取10 g/L为酵母粉的最佳浓度。

图3 酵母粉浓度对菌体生长及产酶的影响

在优化有机氮源的基础上，本实验还考察了NH4Cl,(NH4)2HPO4,NH4NO3,尿素和NaNO35种无机氮源对菌体生长及产酶的影响。然而，结果表明，无机氮源的添加均不利于菌体生长和产酶（实验结果未列出），故在发酵培养基中不添加无机氮源。

2.1.3 金属离子对菌体生长和产酶的影响

金属离子在微生物的生长和生命代谢过程中，常作为辅基和激活剂。本实验考察了不同种类金属离子对菌体生长以及产酶的影响。从表1中可以看出，Mg2+对产酶有一定的促进作用，但对细胞生长并不利；而Zn2+的添加对菌体生长和产酶均有一定的促进作用；添加其他种类的金属离子对细胞生长和产酶都有较为明显抑制。因此，最终确定在培养基中添加0.1 g/L的ZnCl2。

表1 金属离子对菌株生长及产酶影响

2.2 E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT催化肌苷合成 5′-肌苷酸

E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT经培养基优化，酶活力提高后，进一步考察了其特异性选择催化肌苷的效果(图4)。将上述培养条件下获得的发酵液离心得到的微生物细胞作为催化剂，用于合成5′-肌苷酸。在10 mL醋酸钠缓冲液中，于35°C,150 r/min水浴摇床下反应，定时取样分析，结果表明该酸性磷酸酶具有选择性磷酸转移酶活性，能使核苷的5′位磷酸酯化生成5′-肌苷酸。当肌苷浓度为10 g/L时，反应1小时肌苷酸的摩尔收率达到83.3%。

图4 E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT静息细胞催化肌苷

3 结 论

研究了E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT的培养基成分对其生长和产核苷磷酸转移酶的影响，通过单因素试验，确定了最优培养基为：甘油7.5 g/L，蛋白胨 12.5 g/L，酵母粉 10 g/L，NaCl 10 g/L，ZnCl2 0.1 g/L，初始pH值7.0。在该条件下，核苷磷酸转移酶酶活达到143.8 U/L，比优化前提高了1.0倍。

利用该培养条件获得的E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT菌体为生物催化剂，催化肌苷制备 5′-肌苷酸，反应 1 h，5′-肌苷酸的摩尔收率达到83.3%，表明该核苷磷酸转移酶对肌苷具有良好的活性。

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