环氧化酶-2和细胞周期素D1蛋白在胆管癌中的表达及其临床意义

谷化平 黄 勇 尚培中

我们采用免疫组化方法检测胆管癌(CHC)、癌旁胆管组织 (TAC)和正常胆管组织(NBDT)中环氧化酶-2(cyclooxy-genase-2,COX-2)和细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达状况，旨在探讨其表达水平与CHC发生发展和临床病理特征的关系，为判断CHC患者的预后提供生物学参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 选取我院2003年01月～2012年09月手术切除并经病理检查证实的胆管腺癌标本50例。其中男性33例，女性17例，平均年龄(51.8±13.5)岁，年龄23～77岁；高、中分化癌35例、低分化癌15例；有转移者31例(包括淋巴结、肝、胆囊、肠系膜和胰腺等),无转移者19例。TNM分期: Ⅰ期10例,Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。以与CHC同期的20例TAC(距瘤缘0.5 cm)和20例NBDT作为对照。标本均经40 g/L中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.1.2 试剂 鼠抗人COX-2和Cyclin D1单克隆抗体和LSAB试剂盒购自迈新生物技术公司(均为即用型)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用微波-EliVisionTM(MW- EliVisionTM)法，参照试剂盒说明书进行操作。实验以已知COX-2和Cyclin D1阳性大肠癌组织作为阳性对照，以枸橼酸缓冲液代替一抗作为阴性对照。H2O2-DAB显色。

1.2.2 结果判断 COX-2阳性产物定位于细胞质、Cyclin D1阳性产物定位于细胞核，呈棕黄色染色者为阳性。采用单盲法，每张切片在400倍显微镜下选定10个视野，计算阳性细胞数。阴性(-)：未见棕黄色颗粒；弱阳性(+)：阳性细胞数<25%；阳性(++)：阳性细胞数25%～75%；强阳性(+++)：阳性细胞数>75%。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0 软件处理数据，计数资料采用χ2检验，免疫组化指标间相关性采用Spearman相关性分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 COX-2和Cyclin D1在胆管良、恶性病变组织中的表达

CHC、TAC 和 NBDT中COX-2阳性表达率分别为78.0%(39/50)、43.3%(13/30)和0(0/20),差异有显著性(χ2=9.90，χ2=43.03,P<0.05)，TAC 与 NBDT比较有显著差异性(χ2=8.23，P<0.05)；CHC、TAC 和 NBDT中Cyclin D1阳性表达率分别为68.0%(36/50)、36.7%(11/30)和25.0%(5/20),差异有显著性(χ2=9.66,χ2=13.01，P<0.05)，TAC 与 NBDT比较无显著差异性(χ2=0.67，P>0.05)。

2.2 COX-2和Cyclin D1表达与CHC临床病理参数的关系

COX-2表达与CHC患者性别、年龄和肿瘤分化程度无关(P>0.05),而与肿瘤TNM分期和转移状况相关(P<0.05)；Cyclin D1表达与CHC患者性别、年龄无关(P>0.05)，而与肿瘤分化程度、TNM分期和转移状况相关(P<0.05)，见表1。

表1 COX-2和Cyclin D1表达与CHC临床病理参数的关系(例，%)

2.3 胆管癌中COX-2与Cyclin D1表达间的相关性

39例COX-2表达阳性CHC中，Cyclin D1阳性表达有31例(79.5%)；11例COX-2阴性表达CHC中，Cyclin D1阳性表达有5例(45.5%)；CHC组织中COX-2表达与Cyclin D1表达呈显著正相关(γ=0.32，P<0.05)。

3 讨论

近年来肿瘤分子生物学研究表明，恶性肿瘤的形成和转移的发生是一个多基因、多因子各自发挥或相互协同作用的结果。因此，寻找、研究和揭示肿瘤的相关抗原或标志物与肿瘤的关系，对肿瘤诊断、有效防治、预测预后及术后辅助治疗提供依据具有十分重要意义。环氧合酶(cyclooxygenase,COX)又称前列腺素内过氧化物酶，是前列腺素合成过程中一个重要的限速酶，它可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，从而参与机体的多种病理生理过程，如炎症、发热及出凝血机制等。COX是膜结合蛋白，存在于核膜和微粒体膜[1]，它有2种同工酶，即结构型COX-1和诱生型COX-2。COX-2是1种诱导性即刻反应基因，在正常生理状态下，绝大多数正常组织中检测不到COX-2表达，只有当细胞受到刺激才能迅速诱导表达COX-2。近年来研究表明，COX-2除在炎症反应中起重要作用外，尚与肿瘤密切相关，它可通过刺激肿瘤细胞增殖和生长、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管形成、增强细胞侵袭力、抑制机体免疫功能、促进癌前病变向肿瘤转化等肿瘤的形成[2]。研究证实，包括大肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤组织中COX-2表达均明显增高，并与肿瘤的转移明显相关[3～7]。本研究结果显示，在NBDT→TAC→CHC中COX-2表达阳性率逐渐递增(P<0.05)，并随着CHC的TNM分期增高和器官转移其表达阳性率亦随之显著增高(P<0.05)。有关COX-2表达与CHC分化程度的关系研究，目前存在不同结论。Kim等[5]研究结果，COX-2表达与CHC分化程度无关。Wu等[8]研究结果，COX-2表达与CHC分化程度有关。本研究结果显示，COX-2表达与CHC分化程度无关。提示，COX-2在胆管上皮细胞的恶性转化、临床进展和转移过程中起着重要促进作用，可能是CHC发生的早期事件，而对于判断CHC的恶性程度方面意义不大。

Cyclin D1基因是1种原癌基因，定位于染色体11q13,为细胞周期的正性调控因子，与CDK4/CDK6结合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使pRb在G1-S转换期发生磷酸化，释放出E2F，进一步激活S期相关基因的转录，推动细胞从G1期进入S期，该基因编码蛋白质的表达失控有可能引起细胞异常增殖而发生肿瘤。目前已发现Cyclin D1蛋白在人类许多恶性肿瘤如乳腺癌、食管癌、胃癌、胆囊癌、胰腺癌等组织中有过表达出现[9～11]。有关Cyclin D1基因在CHC中的研究文献报道甚少，刘三光等[12]联合应用流式细胞分析术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了CHC、TAC 和 NBDT中的Cyclin D1蛋白和mRNA表达水平，结果显示在CHC、TAC 和 NBDT中，Cyclin D1蛋白和mRNA表达水平均呈现上升趋势(P<0.05)，认为Cyclin D1基因转录和蛋白可能参与了CHC的发生发展过程。本研究结果表明Cyclin D1基因的改变在CHC发生发展过程中起着重要作用，检测Cyclin D1蛋白表达可作为判断CHC恶性程度和生物学行为的参考指标之一。

现代医学研究认为肿瘤的发生是分子事件，是一个涉及多基因、多分子水平变化的多阶段过程。本结果显示，在CHC中COX-2和Cyclin D1表达呈正相关。提示在CHC的发生发展、临床进展和转移的病理过程中，COX-2和Cyclin D1可能发挥着协同作用，共同参与了CHC的演化过程。因此，在临床病理活检中检测CHC中COX-2和Cyclin D1蛋白表达，从不同侧面更有助于深入了解肿瘤的发生发展，并可为诊断、预后判断和临床基因治疗提供重要依据。

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