人骨髓间充质干细胞移植对辐射NOD /SCID小鼠造血重建的影响

胡佳乐 徐立军 徐之明 陈海飞 沈红石 李征洋 唐杰庆 王 静 吴天勤

随着肿瘤发生率的增高，肿瘤放射治疗也随着增多。接受放疗的恶性肿瘤患者的机体都不可避免遭受到放射、辐射带来的伤害。然而，大剂量的放疗、化疗可损伤骨髓基质细胞，严重影响造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)的植入及造血功能的恢复[1～3]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是存在于骨髓中的1种具有多向分化潜能的干细胞，可以增殖分化为各种骨髓基质细胞，能分泌多种造血调节因子，在造血调控过程中起着非常重要作用[4～6]。MSC的异常可引起间质细胞的生长过度或停滞和引起造血调节因子的分泌异常，最终可导致造血系统紊乱[7]。因此，我们将体外培养扩增的人骨髓MSC(hBMSC)与人脐血(umbilical cord blood，UCB)CD34+造血干细胞(UCB HSC)共移植给经60Co γ射线照射的NOD/SCID小鼠，观察其对造血重建的影响，为hBMSC临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 共体细胞

hBMSC，由本实验室分离、培养和鉴定(相关资料另文发表)；UCB HSC，购自中国医学科学院血液病研究所。

1.2 实验动物及分组

30只NOD/SCID小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心，6～8周龄，体重18～20 g，小鼠饲养于SPF级环境中，饲料、饮水、垫料及笼具等物品均经高压蒸气灭菌。随机平均分成5组，除正常对照组(未照射组6只)外，另4组24只NOD/SCID小鼠均给予60Co γ射线照射，照射剂量为350 cGy，剂量率为20 cGy/min。除阴性对照组6只不输入任何细胞，另3组实验组(18只)经60Co γ射线照射的NOD/SCID小鼠作为细胞移植受体[8]。

1.3 细胞移植

3组实验组小鼠照射后4 h内经外侧尾静脉输注上述供体细胞，每只小鼠液体总输注量为0.2 ml。实验1组：6只，单纯输入UCB HSC 5×106/ml；实验2组：6只，输入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×106/ml；实验3组：6只，输入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×108/ml。

1.4 观测指标

细胞移植后继续无菌饮食喂养，观察各组小鼠的一般情况和形态变化，包括小鼠存活情况，皮肤黏膜是否有溃烂、出血，毛发有无缺损等。移植3周后，每周尾静脉取血，检测外周血单个核细胞(MNC)的数量。移植6周后，检测人源供体细胞嵌合情况：实验组小鼠断颈处死后，取其股骨骨髓，制成骨髓细胞悬液100 μl，并调整细胞浓度至1×106/ml，加入20 μl FITC标记的单抗CD45，室温下避光孵育30 min，再加入2 ml溶血素，室温下作用10 min，然后用PBS液洗涤2次，加PBS液至0.5 ml，上机检测。阴性对照：鼠抗鼠IgG1-FITC直标。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 移植后小鼠外观情况

阴性对照组和实验1组小鼠均于2周内死亡，经病理检查确诊，均死于骨髓衰竭。实验2、3组小鼠均存活，并保持良好的生存状态，皮肤黏膜无溃烂、出血现象，毛发无缺损，未发生明显的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，移植4周后，状态接近正常对照组。

2.2 移植后小鼠血象情况

移植后第3周，实验3组外周血MNC数量为(2.66±0.24)×109/L，高于实验2组(1.35 ± 0.20)×109/L(P<0.01)；实验2、3组外周血象逐渐回升；第5周，实验2、3组外周血中MNC水平均接近正常值(表1)。

表1 外周血MNC数量变化

2.3 移植后小鼠供体细胞嵌合情况

移植后第7周，实验2、3组小鼠外周血均检测出供体细胞；实验3组人源细胞嵌合比例为(7.45±0.72)%，高于实验2组[(5.12±0.06)%] (P<0.05)。

3 讨论

本组研究发现，经60Co γ射线照射NOD/SCID小鼠，不输注细胞和单纯输注UCB HSC的2组小鼠均于2周内死于造血功能衰竭；而联合输入UCB HSC和hBMSC的 2组小鼠在移植后造血均获重建，皮肤黏膜无溃烂、出血现象，也无明显GVHD发生。说明单纯输入UCB HSC，植活困难；UCB HSC的成功植入和造血的重建必须有基质成分的协同作用。本研究结果还显示，UCB HSC联合hBMSC移植时，效果与hBMSC用量有关，与5×106/ml组比较，hBMSC用量为5×108/ml组小鼠外周血MNC含量较高，外周血象恢复也较快；稳定植入后，供体细胞嵌合率较高。这可能与hBMSC为造血提供了重要的细胞间接触和生长因子有关[9，10]。hBMSC也可能通过诱导归巢受体表达而引导造血干细胞归巢[11]，还可能是基质细胞组分重建后分泌的大量UCB HSC生长刺激因子，诱导了部分hBMSC向造血细胞的分化[12]。总之，NOD/SCID小鼠致死剂量照射后，联合输入UCB HSC和hBMSC可明显促进造血干细胞移植后的造血重建，且输入hBMSC并不增高GVHD发生率，这为临床应用hBMSC联合UCB HSC移植治疗造血障碍性疾病及多种恶性血液病提供了科学依据。

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