夜香树花甾体皂苷抑制K562细胞增殖及对PI3K/AKt信号通路的调控

罗发军 赵世元 钟振国

夜香树，又名夜来香，茄科夜香树属植物(Cestrum nocturnum，Linn)。原产热带美洲,现广植于热带、亚热带地区,我国广东、广西、福建、云南均有栽培，每年开花约6次，资源非常丰富。我们曾报道夜香树提取物体内外有较强地抗肿瘤作用[1-4]。本实验从夜香树花中提取得到夜香树花皂苷(以下简称SSFCN)，体外培养人白血病K562细胞,用不同浓度的SSFCN处理K562细胞,MTT法检测SSFCN对K562细胞的增殖抑制作用，应用流式细胞仪检测SSFCN对K562细胞周期的阻滞作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

人慢性髓源白血病细胞系K562细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，常规培养于10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中悬浮培养。

1.2 夜香树花甾体皂苷(SSFCN)的提取

取干燥的夜香树花2.3 kg，用乙醇浸泡24 h，加热回流提取，过滤，减压浓缩得浸膏，乙醇浸膏用硅胶拌匀后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇回流提取，回收溶剂，获得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。取正丁醇部位浸膏100 g，用硅胶拌匀后，采用硅胶柱色谱法分离，先用氯仿-甲醇梯度洗脱，经簿层检识后将相同的溶液合并，直至氯仿-甲醇比例为20∶1时，发现有结晶析出，经反复硅胶柱层析，氯仿甲醇混合物液洗脱，甲醇重结晶。得到1种不定型的结晶物，该化合物的曲线下面积为99.56%。经不同系统进行薄层层析检识、高效液相色谱法、酸性水解测定其糖苷基团的结构、光谱分析，结合氢谱和碳谱(600 MHz)元素分析表明，该化合物单体含C、H、O 3种元素等；含量达99.1%，经鉴定为甾体皂苷类化合物。

1.3 主要试剂与仪器

新生牛血清购自美国Hyclone公司；RPMI Medium 1640购自美国GIBCO公司；MTT 、Hoechst33342染色Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒caspase-3、cytochtome c等购自碧云天生物技术研究所。CO2培养箱(Thermo Forma，型号38) ；流式细胞仪(美国库尔特公司)；倒置荧光显微镜(Nikon,型号TE20002U) ；倒置显微镜(Olym2pus,型号CK40) ；酶标仪(B iocell,型号Sunris)；凝胶成像系统(Bio-RAD)。

1.4 MTT法测定药物对细胞增殖抑制作用[5]

RPMI 1640完全培养基(GIB-CO)、3%谷胺酰胺、卡那霉素750 mg/L，用缓冲液调pH至6.8～7.2，滤菌后4℃冰箱内保存备用。选对数生长期的白血病细胞K562细胞，用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基配成5000个/mL的细胞悬液，在96孔培养板中每孔加入200 μl上述细胞悬液，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后,离心去上清液，实验组分别加入终浓度为60 μg/mL、30 mg/L、15 mg/L 、7.5 mg/L、3.8 mg/L的SSFCN(含10% FBS的RPMI 1640培养液)；阳性对照组加入终浓度为60 mg/L的As2O3(含10% FBS的RPMI 1640培养液)，对照组则加入200 μl的10%胎牛血清的RPMI 1640培养基细胞悬液，每组4孔(实验重复3次)。置37℃、5% CO2培养箱中培养4天后离心弃上清，每孔加入200 μl新鲜配制的含0.2 mg/ mL MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h，离心弃上清，加入200 μl /孔 DMSO，振荡混匀后，用波长为550 nm、参比波长为450 nm的酶标仪测定OD值，测定时减去空白对照。按下列公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。

肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100%

1.5 流式细胞仪分析(PI染色法)[6]

取对数生长期K562细胞,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成1×106个/ml细胞悬液,分装在培养瓶中,实验组加入SSFCN终浓度为30 μg/ml，对照组加等体积培养基,置于含5% CO2、37℃温箱中分别培养24 h、48 h、72 h,离心收集细胞,然后用PBS液洗1次，加入70%乙醇4℃过夜；弃去70%乙醇,用PBS液清洗2次，加0.5ml PBS充分混匀细胞,加入终浓度为100 μg/ml RNAase A，37℃消化1 h,加入2 mmol/L,Hoechst 33258 2 μl和PI(propidium iodide)4℃染色1 h,然后在Epicsxl流式细胞仪上进行检测，氩离子激光器488 nm或514 nm波长激发;阻断滤片为620 nm长波通滤片。

1.6 K562细胞DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳分析[7]

取对数生长期K562细胞，分别接种于3个培养皿中，常规培养24 h，更换含0.5%小牛血清的 RPMI-1640培养液，24 h后加入0.5 mg/L SSFCN，阴性对照组平皿中加等量的DMSO(终浓度为培养总体积的1%)。加药15 h后，用0.6 mL细胞裂解液(0.5% TritonX -100,5 mmol/L EDTA 、10 mmol/L Tri,pH 7.4)裂解细胞，然后用等体积的酚-氯仿提取3次，乙醇沉淀后，将DNA沉淀溶于20 l TE(pH 7.8)中，用1.5%琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析。紫外光下观察“DNA条带”并摄影。

1.7 Western blot 法检测SSFCN处理K562细胞后AKt磷酸化水平

处于对数生长期的K562细胞,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成1×106个/ml细胞悬液,分装在培养瓶中,分别加入终浓度为30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml的SSFCN，对照组加等体积培养基,置于含5% CO2、37℃ 温箱中培养72 h,离心收集细胞，分别加入200 μl预冷的蛋白裂解液，放置于4℃裂解60 min，冰浴下超声裂解15 min，冷冻离心15 min，采用Bradford法检测蛋白浓度，分装后置-70℃保存。取等量蛋白(20 μg)进行SDS-PAGE电泳分离，先恒压100V电泳20 min随后150V电泳60 min，然后在250 mA的条件下电转膜90 min，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入相应的Ⅰ抗过夜；加入相应的生物素化Ⅱ抗(均为1∶2000稀释)室温2 h。再加入ABC复合物室温30 min，加入DAB显色液，实验在相同条件下重复3次。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 SSFCN对K562细胞的增殖抑制作用

分别用浓度为60 μg/ml、30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml、3.75 μg/ml的SSFCN，处理处于对数生长期的K562细胞72 h后,采用MTT法检测SSFCN对 K562细胞的增殖抑制作用，结果表明，SSFCN对K562细胞生长呈明显抑制作用，呈浓度依赖性，浓度越高，作用时间越长，SSFCN对细胞生长抑制作用越强，见表1。

表1 MTT法检测不同浓度SSFCN对K562细胞的抑制作用

2.2 SSFCN对 K562 细胞的细胞周期和凋亡的影响

流式细胞仪分析，与对照组相比，30 mg/L SSFCN处理 K562 细胞24 h、48 h、72 h后，G0/G1期细胞周期无明显变化，S期细胞比例逐渐增大,从45.8%→49.3%→51.5%；G2+M期细胞比例逐渐减小,从19.1%→17.2%→14.5%；与对照组比较，细胞周期中细胞比例的改变以72 h最为明显(G1期46.8%→34.1%,S期38.5%→51.5%，G2+M期没有明显的变化)。随着药物作用K562细胞时间的延长，细胞凋亡数量逐渐增加，作用72 h，其凋亡率达31.2%，而对照组仅为4%～6%，两组相比差异显著，见表2，30 mg/L SSFCN处理K562 细胞，流式细胞仪检测发现有明显的亚倍体峰。

表2 30 mg/L SSFCN 作用不同时间对 K562 细胞周期及凋亡的影响

2.3 DNA凝胶电泳分析

以30 μg/ml SSFCN作用K562细胞24 h、48 h、72 h 药物诱导的DNA断裂。结果表明，SSFCN 作用K562细胞24 h后，DNA没有裂解成小分子DNA片段，作用48 h后，才观察到“DNA ladder”，表明经SSFCN处理后K562细胞发生细胞凋亡(图1)。

2.4 不同浓度SSFCN处理K562细胞72 h P-AKt表达水平变化

不同浓度SSFCN作用K562细胞后，AKt水平无明显变化(P>0.05)，P-AKt308和P-AKt473的磷酸化水平明显下调，随着SSFCN浓度的增高，其水平下调更加明显(F=63.5，P<0.01)(图2)。

图1 SSFCN作用K562细胞不同时间的DNA凝胶电泳图像

图2 不同浓度SSFCN处理K562细胞72 h后P-AKt表达水平的变化

3 讨论

细胞凋亡是受基因调控的主动的细胞死亡过程，有其特征性的形态和生化特征，而细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化关系密切[8]。细胞通过2个限制点(G1/S和G2/M)保证细胞的忠实复制。当细胞受损时，通过激活限制点，分别导致细胞的G1期和G2期延迟，使细胞有时间完成复制前和有丝分裂的修复，以保证细胞高质量的存活，当损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞凋亡。本研究从细胞增殖、流式细胞仪、细胞DNA琼脂糖凝胶电泳分析等来确认SSFCN诱导K562细胞凋亡发生。从MTT法抑制作用实验结果来看，SSFCN各剂量组均能使K562细胞数量明显下降，IC50<20 μg/ml，进一步证实SSFCN体外抑瘤作用；本组流式细胞仪检测结果证实随着SSFCN作用时间延长肿瘤细胞发生凋亡增强；通过琼脂糖凝胶电泳检测出现有DNA Ladder，再一次证实我们的假设。

PI3K是1种细胞内蛋白激酶，是细胞内重要的信号转导分子，AKt是细胞内的信号分子，是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，具有丝/苏氨酸激酶活性，PI3K/AKt信号通路与细胞的生长、增殖、维持细胞生存等具有重要作用[9]。PI3K受到生长因子刺激后被激活，对磷脂酰肌醇环上3位羟基进行磷酸化生成PIP3，在磷脂酰肌醇依赖蛋白激酶(PDK)的协助下，AKt从细胞质转位到细胞膜，促使其结构发生变化，在Ser308和Thr308位点磷酸化激活，AKt活化后，其下游因子也被进一步激活，对细胞周期、凋亡产生调节作用。已经证实，多种肿瘤组织如肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌等组织中AKt异常激活[10-11],通过负调节PI3K/AKt信号通路，才能抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡，加速死亡[12]。本组结果提示SSFCN作用于K562细胞后，可能负性调节PI3K/AKt信号通路，从而诱导K562细胞凋亡，但其机制仍需进一步研究。

如上所述，SSFCN具有抑制K562细胞的增殖和促进凋亡的能力，机制可能抑制K562细胞PI3K/AKt信号通路，从而抑制K562细胞增殖。本研究为开发SSFCN治疗慢性白血病提供理论依据。

[1] 赵世元，钟振国，廖 文，等.夜香树提取物体外抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.天然产物研究与开发，2008，20(1)：125.

[2] 钟振国，赵世元，吕金燕，等.夜香树提取物体内抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.中药材，2008，31(11)：1709.

[3] 赵世元，钟振国，廖 文，等.夜香树提取物体外抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.天然产物研究与开发，2008，20(1)：12.

[4] 赵世元,农智新,叶海洪，等.夜香树叶甾体皂苷对人肝癌细胞株BEL-7404增殖抑制作用机制研究〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013，(7):212.

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