5-羟基癸酸钠对无创肢体缺血预适应心脏保护作用的影响

侯 微，袁恒杰，温 克，吴艳娜，娄建石

肢体缺血预适应(limb ischemic preconditioning，LIP)是指反复短暂的肢体缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)对其他组织器官(如心脏、脑等［1－5］)的长时间I/R损伤具有保护作用。与心脏原位缺血预适应比较，LIP具有方便可行的优势，具有更大的临床应用价值。本实验室前期研究表明，连续3 d的LIP可提供与心脏原位缺血预适应强度相当的保护作用［6］，且能改善长时间心肌I/R造成纤溶系统失衡状态。本研究探讨LIP对凝血功能的影响，以及线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)在 LIP心脏保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康♂ Wistar大鼠56只，体质量240～270 g〔二级，实验动物质量合格证许可证号:SCXK(京)2007-0001〕，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 5-羟基癸酸钠(5-hydroxydecanoate，5-HD)，BioMol，美国;活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)测定试剂盒，天津美德太平洋科技有限公司;凝血酶原时间(prothrombin time，PT)测定试剂盒，Instrumentation Laboratory Company;纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)测定试剂盒，Fisher Scientific Company L.L.C;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，Sigma;原位细胞凋亡检测试剂盒，Roehe;BP-动物无创血压测定仪、BL-420E生物机能实验系统、HX-300动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司;CA-7000全自动血液分析仪，Sysmex;2050型自动石蜡切片机，Leica，德国;Bx50F4型光学显微镜，Olympus，日本;HIl220型切片烘干机，Leica，德国。

1.3 模型制备［7］

1.3.1 心肌I/R损伤模型 大鼠以25%乌拉坦(1 g·kg－1)腹腔注射麻醉，连续监测标准Ⅱ导联心电图和血压。开胸，在冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下穿线，丝线两端共同穿过一末端为球形的聚乙烯小管，形成一活结。拉紧活结造成LAD供血区心肌缺血，放松活结使心肌恢复血流灌注。大鼠行LAD结扎30 min缺血，继之120 min再灌注。

1.3.2 无创肢体缺血预适应模型 大鼠以1%戊巴比妥钠(30 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，将改良的动物无创血压测试仪自制套管置于大鼠左后肢根部，脉搏传感器紧贴在足背动脉上，应用动物无创血压测量系统，连续监测血压和脉搏。加压，以脉搏消失、肢体远端体温下降、皮肤发绀为阻断股动脉标志，持续5 min;减压，以脉搏出现、肢体远端体温回升、皮肤潮红为再灌注标志，持续5 min，重复3个循环为1次LIP。每天1次，连续3 d。

1.4 实验分组 健康♂ Wistar大鼠56只，随机分为4组。

1.4.1 I/R组(n=14) 大鼠连续3 d腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg·kg－1)。d 4，LAD 经历30 min 缺血/120 min再灌注。于30 min缺血前10 min股静脉注射与药物等体积的生理盐水(normal saline，NS)，并于I/R期间用注射泵恒速静脉输入与药物等体积的NS。

1.4.2 I/R+5-HD 组(n=14)I/R 损伤模型大鼠于d 4 30 min缺血前10 min股静脉注射5-HD溶液9 mg·kg－1。并于I/R期间用注射泵恒速静脉输入5-HD溶液1 mg·kg－1。余同I/R组。

1.4.3 LIP组(n=14)LIP模型大鼠每天经历3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，连续3 d。d 4对心脏LAD实施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R组。

1.4.4 LIP+5-HD 组(n=14)LIP 模型大鼠每天经历3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，连续3 d。d 4对心脏LAD实施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R+5-HD组。

1.5 检测指标

1.5.1 血压与心率 在大鼠LAD结扎前、LAD结扎立即、15和30 min以及再灌30、120 min记录收缩压、舒张压和心率，并计算平均动脉压。

1.5.2 心肌梗死面积 于再灌注120 min末立即结扎LAD，股静脉注射0.6%台盼蓝2 ml。迅速取下心脏，洗净残血，－20℃冰箱冷冻20 min。由心尖部向心基部将心脏切成1mm厚切片，未被蓝染的为危险区(area at risk，AAR)，将其进行1%TTC染色20 min，濒死区心肌组织被染为砖红色，梗死区(infarct size，IS)为灰白色，用10%福尔马林溶液固定标本，将IS从AAR中分离出来，电子天平称重，以IS占AAR重量的百分比(IS/AAR%)计算梗死面积。

1.5.3 心肌细胞凋亡 于再灌注120 min末，迅速剪下心脏，NS洗净残血。将靠近心尖部分的心肌组织置10%福尔马林中固定，心肌组织切片常规脱蜡水化，按TUNEL试剂盒说明书操作。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。每张切片计数5个高倍镜视野(400×)中的凋亡阳性细胞核数和总细胞核数，各取其平均值，以凋亡阳性细胞数和细胞总数之比计算心肌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。

1.5.4 HE染色观察心肌形态 上述石蜡切片行HE染色，定性观察心肌形态学改变。

1.5.5 凝血功能 各组于缺血前和再灌注120 min末由股静脉取血1 ml，置于含有3.8%柠檬酸钠的试管中(抗凝剂与全血的体积比为1∶9)，立即混匀。以400×g的速度离心10 min，收集血浆，按FIB、PT、APTT检测试剂盒说明书分别进行测定。

2 结果

2.1 血压与心率 缺血后，各组的平均动脉压和心率均呈降低趋势，再灌注后有所回升，但均低于缺血前水平，各组间各时点差异无显著性。

2.2 心肌梗死面积 各组AAR差异无显著性。与I/R组相比，I/R+5-HD组IS和IS/AAR比值差异无显著性，说明5-HD自身对心肌梗死面积无影响;LIP组IS明显缩小约40%(P＜0.01);IS/AAR比值明显降低约38.24%(P＜0.05)。而5-HD取消LIP缩小心肌梗死面积的作用。见Fig 1。

Fig 1 Effects of various interventions on myocardial infarctsize during I/R in rats(n=8)

2.3 心肌细胞凋亡 I/R组和I/R+5-HD组AI差异无显著性，说明5-HD自身对细胞凋亡无影响。与I/R组比较，LIP组 AI降低约 23.33%(P＜0.01)，此作用被5-HD取消。见Fig 2。

2.4 心肌形态 I/R组、I/R+5-HD组、LIP+5-HD组心肌纤维横纹消失，肌束断裂，心肌细胞混浊变性，大部分心肌细胞膜不完整，胞质嗜酸性变，细胞核溶解消失，大量红细胞渗出及炎细胞浸润。LIP组心肌纤维横纹、心肌细胞核膜较清晰，偶见肌束断裂，大部分心肌细胞膜完整，少量红细胞渗出及炎细胞浸润。见Fig 3。

Fig 2 Effects of various interventions on cardiocyte apoptosis during I/R in rats(n=6)

Fig 3 Effects of various interventions on myocardial morphousduring I/R in rats(HE staining，×400)

2.5 凝血功能

2.5.1 FIB LIP对血浆FIB无影响。I/R后，FIB均明显增加(P＜0.01)。I/R组和I/R+5-HD组之间差异无显著性，说明5-HD自身对FIB无影响。LIP组FIB明显低于I/R组约12.5%(P＜0.05)。5-HD取消LIP降低FIB升高程度的作用。见Fig 4。2.5.2 PT 30 min缺血前各组大鼠PT差异无显著性。I/R后，各组PT均延长，但各组间差异无显著性。见Fig 5。

2.5.3 APTT 与30 min缺血前比较，各组 APTT无变化。见Fig 6。

3 讨论

本研究结果表明，LIP可缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，改善心肌形态学损伤，降低FIB在I/R后的增加幅度，上述保护作用被5-HD取消，提示mitoKATP可能参与介导LIP的心脏保护作用。

Fig 4 Effects of various interventions onconcentration of FIB in rats(n=8)

Fig 5 Effects of various interventions on PT in rats(n=8)

Fig 6 Effects of various interventions on APTT in rats(n=8)

LIP心脏保护作用机制尚不明确，可能涉及神经、体液调节机制或者两者的共同作用［8－9］。腺苷、阿片类物质、ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)、内源性大麻素类、热休克蛋白等均有报道可能参与LIP的心脏保护作用。KATP存在两种类型，分别位于线粒体和细胞膜上。5-HD曾被认为是mitoKATP的特异性阻断剂，但近年来的研究提示5-HD还可阻断膜KATP，并影响内源性脂肪酸的 β-氧化过程［10－11］。Schmidt等［12］在猪的 I/R模型中，发现对肢体进行远端缺血预适应可以减缓恶性的心律失常，减少心肌梗死面积，对心脏起到保护作用，而mitoKATP抑制剂格列本脲可以消除其保护作用，提示mitoKATP开放是关键作用。但Zhao等［13］发现，小猪的肢体远端缺血预适应对I/R的保护作用与细胞膜上的KATP关系密切，而非mitoKATP。Wu等［14］在大鼠无创延迟肢体缺血预适应中发现，5-HD可以取消LIP缩小心肌梗死面积、缓解恶性室性心律失常等保护作用。本研究表明LIP可缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，改善心肌形态学损伤，LIP的心脏保护作用被5-HD取消，提示KATP的开放可能在LIP心脏保护中具有重要的调节作用，但鉴于5-HD作用的复杂性，需在后续研究中使用特异性阻断剂判断起关键性调节作用的KATP类型。

本课题组前期对LIP对纤溶系统的影响进行研究，发现LIP能明显对抗血浆中组织型纤溶酶原激活剂的降低和纤溶酶原激活剂抑制物－1活性的升高，推测LIP能纠正心肌I/R时纤溶活性降低的状态，抑制血栓的形成从而保护心肌［15］。本研究对凝血指标进行初步检测，发现LIP对基础状态下的凝血功能无影响，但能降低I/R后血浆FIB增加程度。提示LIP可能通过减少FIB，防止或减少血栓形成，改善血流动力学，减轻I/R损伤。此作用被5-HD取消，提示KATP可能参与其中，机制尚需进一步研究。

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