吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的研究

彭 菊，刘 伟，罗超华，陈小辉，张文清，莫志贤

斑马鱼(Danio rerio，zebrafish)，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。其具有体积小，产卵量大，胚胎繁殖迅速且整体透明，易于活体观察［1］等特点，作为一种新的模式生物越来越多的应用于各种人类疾病模型的建立以及药物的高通量筛选。与大鼠、小鼠等哺乳动物相比，斑马鱼给药量少且给药方式简单;与果蝇等低等动物相比，斑马鱼基因图谱与人类有极大的相似;与细胞模型相比，斑马鱼拥有整体生物优势以及能够进行靶向给药的特点［2－3］。利用它的众多优点，斑马鱼作为一种新型模式生物在行为学上的应用前景也逐渐被研究者所认识，利用斑马鱼进行药物依赖研究的报道也逐渐出现［1，4］。

目前，国外利用斑马鱼进行药物依赖的研究主要集中在研究斑马鱼对成瘾药物产生的学习记忆［5］、成瘾药物诱导的位置偏爱［6－8］、成瘾药物戒断症状研究［8－9］、成瘾药物引起的斑马鱼脑内蛋白表达的改变以及相关的行为学变化［9－10］等几个方面。国内也陆续开始了对斑马鱼药物依赖机制的研究［4，11］。本研究利用条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)原理并结合斑马鱼的生物学特性，旨在建立斑马鱼的吗啡依赖模型，为进一步研究药物依赖的戒断提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 盐酸吗啡，解放军总后勤部药品供应站提供，批号:710303。鱼用生理盐水，自配，NaCl浓度为100 mmol·L－1。Tricaine methanesulfonate(MS222)，购自 Sigma公司。

1.1.2 仪器 Noldus EthoVision XT 8.5(荷兰 Noldus公司提供)。

1.1.3 动物 野生型AB系斑马鱼，由南方医科大学斑马鱼实验中心提供，鱼龄:4～7个月。养鱼系统为北京爱生公司净水系统，系统温度控制在28.5℃ ～29.5℃;盐浓度为0.03% ～0.04%;pH 7.2～7.6;昼夜光照控制14 h光照(8∶30 am～10∶30 pm)，10 h黑夜。正常喂食，每天两次，实验用鱼♀♂各半(50∶50)，且在实验前于独立安静的环境中适应性喂养3～5 d。

1.2 方法

1.2.1 CPP箱的制作 参考小鼠CPP箱的制作方法及参考文献［12］，取塑料鱼缸，长16 cm，宽9 cm，高9 cm。将鱼缸分为等体积的两个箱，一箱为褐色，一箱为透明，两箱中间用一个透明的活动挡板隔开。

1.2.2 斑马鱼基线测定 斑马鱼在独立的CPP箱(抽出挡板)中适应性喂养2d，CPP箱中水位不低于5 cm。于d 3观察其15 min，以头部位置为准记录斑马鱼在两箱中活动时间。基线测定结果表明大于95%的斑马鱼偏爱于褐色箱体，故以CPP箱的褐色箱体部分作为斑马鱼的偏爱箱，透明箱体部分为非偏爱箱(伴药箱)。此后斑马鱼基线测定以其在非偏爱箱中的活动时间≥8 min为合格。

1.2.3 CPP模型建立 (1)分组:取基线测定合格的斑马鱼60 条，称重，随机分为生理盐水组，30、40、50、60、90 μg·g－1吗啡剂量组，每组10条，♀♂各半。(2)观察:于正式实验d1测定斑马鱼15 min内于CPP箱透明侧(非偏爱箱)的活动时间，并用Noldus EthoVision XT 8.5软件追踪斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹(5 min)。(3)训练:于实验d 2、d 4、d 6将斑马鱼浸入50 mg·L－1的tricaine methanesulfonate溶液中进行麻醉(麻醉以用手能顺利捞起斑马鱼但其仍保持正常游动姿势为度)，用微量注射器迅速腹腔注射各浓度吗啡(空白组注射生理盐水)，再将其放入系统水中30 s，待其麻醉恢复后，放入伴药箱内40 min，同时用透明挡板隔开，训练结束后将斑马鱼移至较大的有蓝色环境的鱼缸中，并清洗CPP箱。d 3、d 5同一时间斑马鱼腹腔注射与吗啡同体积生理盐水，将其放入偏爱箱内40 min。(4)观察:在末次给药24 h后，即d 7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间并比较训练前后各条斑马鱼在伴药箱活动时间的差值(斑马鱼训练后在伴药箱中的活动时间﹣斑马鱼训练前在伴药箱中的活动时间)，同时分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹及运动总路程。

2 结果

2.1 斑马鱼训练前后在伴药箱的活动时间变化 Tab 1显示，以腹腔注射给药的方式，各组斑马鱼训练之前在伴药箱的活动时间无差异(P＞0.05)，而腹腔注射吗啡并进行连续3 次训练后，40、50、60 μg·g－1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的活动时间比训练前均明显增加(P＜0.05)，而比较训练前后时间的差值，40、50 μg·g－1吗啡组斑马鱼与生理盐水组比较差异有显著性(P＜0.01)，说明腹腔注射40～50 μg·g－1吗啡并对斑马鱼进行连续3次训练能够诱导其CPP的形成。

Tab 1 Change of activity time of zebrafish in non-preferred compartment between pre-and post training by intraperitoneal injection of morphine(¯ ± s，n=10)

Tab 1 Change of activity time of zebrafish in non-preferred compartment between pre-and post training by intraperitoneal injection of morphine(¯ ± s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pre-training;△△P＜0.01 vs saline

Group Dose/μg·g－1 Zebrafish activity time in non-preferred compartment/s Pre-training Post three trainings Time difference between pre-and post three training/s Saline － 194.00 ±98.298 190.40±84.827 －3.60±66.700 Morphine 30 212.40 ±87.746 239.70 ±100.428 27.30 ±78.974 40 195.70 ±113.091 530.30±145.488＊＊ 334.60±164.661△△50 192.60 ±81.011 376.50±110.251＊＊ 183.90±170.466△△60 213.40 ±95.807 298.60 ±124.406* 85.20 ±108.912 90 172.10 ±81.620 250.40 ±165.076 78.30 ±148.417

2.2 斑马鱼训练前后在伴药箱中的运动总路程变化 利用Noldus EthoVision XT 8.5软件分析出斑马鱼5 min内在伴药箱中的运动总路程。由Tab 2可知，各组斑马鱼训练之前，在伴药箱中的运动路程无差异，而训练之后，40、50 μg·g－1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的总路程明显延长(P＜0.01)。

Tab 2 Change of total movement path of zebrafish innon-preferred compartment within 5min(¯±s，n=10)

Tab 2 Change of total movement path of zebrafish innon-preferred compartment within 5min(¯±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pre-training;△△P ＜0.01 vs saline

Group Dose/μg·g－1 Total movement path of zebrafish in non-preferred compartment/cm Pre-training Post three trainings Saline － 149.63 ±97.64 199.18 ±180.91 Morphine 30 116.63 ±101.65 162.98 ±172.57 40 204.21 ±159.89 662.71 ±171.65△△＊＊50 192.71 ±182.90 529.52 ±312.16△△＊＊60 183.21 ±177.04 345.27 ±165.35*90 221.09 ±169.27 153.24 ±172.98

2.3 斑马鱼造模前后在CPP箱的活动轨迹图 斑马鱼连续3次注射吗啡后，其在非偏爱箱中的运动轨迹均有增多，而以注射40 μg·g－1的吗啡斑马鱼的轨迹改变最为明显，见Fig 1。

Fig 1 Activity route of two zebrafish groups in CPP compartment

3 讨论

CPP的形成机制可能与一些经典的条件反射实验相似，其基本原理是以某种自然奖励或成瘾药物作为非条件刺激，将其与某个特定的非奖赏中性刺激(如某特定环境)反复相联系之后，后者便可获得某种奖赏特性，即这一特定非奖赏中性刺激可以诱发最初与非条件刺激联系在一起的那种非条件行为效应［13］。CPP实验是目前国内外评价药物精神依赖性的经典实验模型，也是广泛应用于寻找抗觅药行为的有效工具。本研究通过对吗啡诱导的斑马鱼CPP条件的探索，旨在选取建立斑马鱼吗啡依赖模型的最佳条件。本研究前期采用浸泡给药的方法，单次训练和连续3次训练之后，均无法使其在伴药箱中的活动时间明显增强。导致该结果的原因可能是吗啡药液的浓度不够，也可能因为浸泡给药斑马鱼对药物的吸收程度过低，或者训练次数的不足。

通过改进给药方法，采用腹腔注射给药的方式，斑马鱼在单次注射吗啡之后即能产生不同程度的CPP效应，而通过连续3次训练之后，注射40～60 μg·g－1的吗啡都能使斑马鱼在伴药箱中的活动时间延长，但注射90 μg·g－1的吗啡却不能引起斑马鱼在伴药箱中的活动时间延长，说明过高剂量的吗啡对斑马鱼形成CPP无益。与生理盐水组相比，仅40、50 μg·g－1的吗啡能引起斑马鱼训练前后在伴药箱的活动时间差值明显增大，说明诱导斑马鱼形成CPP的最佳吗啡浓度为 40 ～50 μg·g－1。

斑马鱼经过连续 3 次训练之后，40、50 μg·g－1吗啡组在伴药箱中的运动总路程明显延长。表明给药训练之后，斑马鱼对伴药箱的偏爱大大增加，无论是在伴药箱中的活动时间，还是运动总路程，都证明连续3次注射吗啡的训练能诱导斑马鱼位置偏爱的形成。而综合斑马鱼训练前后在伴药箱中活动时间和运动总路程的结果，初步探索出采用腹腔注射给予40～50 μg·g－1吗啡，并经过连续3次训练，能建立稳定的斑马鱼CPP模型。

斑马鱼连续注射不同剂量的吗啡，仅 40、50 μg·g－1吗啡组的斑马鱼在伴药箱中的活动时间明显增加，运动总路程明显延长，说明斑马鱼产生CPP效应的吗啡剂量范围较窄。当吗啡剂量低于40 μg·g－1时，斑马鱼的CPP效应明显降低，当剂量为30 μg·g－1时，斑马鱼在CPP箱中的活动时间变化差异已无显著性。因此，在建模过程中吗啡的浓度选择非常重要，这也是本模型建立成功的关键所在。

在研究中，除了对吗啡剂量、训练次数以及给药方法的控制外，应要求对实验过程中环境温度，系统水温严格控制，并尽最大可能避免人为因素的干扰。腹腔注射给药具有给药剂量小且剂量准确的优点。斑马鱼腹腔注射的操作应迅速、准确，减小操作对斑马鱼行为的影响，注射时可用一块带有凹槽(宽度与斑马鱼体宽接近，凹槽中添加系统水)的琼脂板对处于浅麻醉状态的斑马鱼进行固定，可避免其在操作过程中离开水时间过长所造成的伤害。在每次斑马鱼给药训练结束之后，应及时用70%的乙醇清洗CPP箱，因斑马鱼对气味的刺激极其敏感，当使用同一个CPP箱进行多轮或多次实验时，斑马鱼可能因嗅觉的影响模仿前一条斑马鱼的轨迹来运动，而不是根据其本身在CPP中的天然偏爱进行活动。

斑马鱼因具有生长快速，研究周期短，给药剂量小且饲养方便等诸多优点，越来越多地应用于各种药物的高通量筛选。与哺乳动物相比，斑马鱼神经系统相对简单，但其能极好地控制学习、成瘾、抑郁等复杂行为，这种组织与系统间简单性与复杂性的良好平衡，使得其在研究药物对其行为影响方面极具优势［12］。国外研究表明，斑马鱼体内存在与哺乳动物功能相似的阿片受体，而且该受体与吗啡的成瘾性有关［14］。Mathur等［7］研究结果也显示将斑马鱼暴露于低剂量的吗啡即能诱导其在吗啡药液侧活动时间的延长。目前，国内针对药物依赖的研究主要集中于大、小鼠模型，而单一的模式生物在研究中有很大的局限性，因此，将斑马鱼引入毒瘾医学领域，利用斑马鱼的各项生物学优势为药物依赖研究服务，不仅丰富了药物依赖的模型，而且为将来成瘾戒断药物的筛选提供更有力的保障。

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