转染NY-ESO-1特异性TCR增强人PBMC对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的特异性细胞毒性

郭 佳，田 洲，顾 娜，徐 珩，闾 军*

(1.首都医科大学附属北京佑安医院肝病与肿瘤生物治疗科，北京100069;2.安徽医科大学基础医学院，安徽合肥230032)

众所周知，绝大多数肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen，TAA)是自身抗原。因为胸腺的选择机制和耐受机制，机体针对这些抗原产生的大多数TCR(T Cell Receptor，TCR)亲和力较低，限制了对肿瘤细胞的识别及杀伤效果。所以，对肿瘤抗原的识别可能是肿瘤免疫研究领域面临的最大挑战［1］。近年来基于TCR基因转导的过继性免疫治疗在众多肿瘤免疫治疗途径中逐渐引起关注［2］。NY-ESO-1抗原属于癌-睾丸抗原(Cancer-testis Antigens，CTA)家族，抗原性强，在多种肿瘤组织表达［3］，但正常组织中仅睾丸组织表达。睾丸组织不表达MHCⅠ类及Ⅱ类分子，所以不会被T细胞识别杀伤［4］。

本实验室已构建HLA-A2限制性NY-ESO-1特异性TCR质粒-pCDNA3.1-ESO-TCR。本研究尝试将该质粒电转到HLA-A2+正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，观察特异性TCR在细胞表面表达情况，并检测电转后PBMC的体外特异性细胞毒性作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

1.1.1 试剂及多肽:pCDNA-3.1-ESO-TCR质粒(本实验室构建)、无内毒素大提质粒试剂盒(天根试剂有限公司)、IMSF100无血清培养基(Immunotech UK Ltd)、Ficoll淋巴细胞分离液(Norway公司)、1640细胞培养基(北京钮因公司)、Recombinant Human IL-2(Peprotech公司)、OKT3(Biolengd公司)和 Human IFN-γELISPOT Kit(U-Cytech公司)等;NY-ESO-1b多肽(-SLLMWITQC-)和flu多肽(-GILGFVFTL-)(均由北京赛百盛公司合成)。

1.1.2 细胞:经供者本人知情同意，由正常人外周血中分离获得PBMC;NY-ESO-1阳性HepG2细胞、NYESO-1阴性HepG2细胞和T2细胞(均本实验室保存)。

1.2 p CDNA3.1-ESO-TCR质粒提取

操作前将菌种接种于含Amp的液体LB培养基内。180 r/min，37℃恒温振荡培养16 h。按无内毒素大提质粒试剂盒说明书操作提取质粒。用紫外分光光度计检测所提质粒浓度及纯度。

1.3 p CDNA3.1-ESO-TCR转导入正常人PBMC

用Ficoll淋巴细胞分离液分离HLA-A2+正常人外周抗凝血10 mL，获得PBMC。计数后加入冻存液，调整细胞浓度为106/mL，于液氮中保存。电转前，复苏4×106个PBMC，加入4 mL PBMC无血清培养基 (含IL-2终浓度106IU/L，OKT3 5μg/L)吹打成单细胞悬液，移至12孔板。37℃，5%CO2条件下培养2～3 d。计数细胞并移至2支无菌1.5 mL离心管，密度为2 ×106个PBMC/管。标记 1#、2#，离心弃上清。将30μg pCDNA3.1-ESO-TCR质粒溶于400μL无血清专用培养基，用此混合液重悬1#管细胞;同时将5μg pCDNA3.1(+)载体加入400μL无血清培养基重悬2#管细胞，分别移至电转杯。同时计数2×106个PBMC，电转5μg Pmax-GFP质粒作为阳性对照。设定电转条件220 V-10 ms-5 pulse。电转后将细胞悬液移至12孔板，每孔加入1.5 mL无血清培养基(含IL-2终浓度106IU/L，OKT3 5 mg/L)，1#为电转pCDNA3.1-ESO-TCR质粒的细胞，以下简称ESO-TCR PBMC，2#为电转 pCDNA3.1(+)载体的PBMC，以下简称空电转PBMC。37℃，5%CO2条件下培养48 h。

1.4 体外聚合酶链反应扩增NY-ESO-1 TCR基因片段

收集细胞，提取RNA后，采用RT-PCR技术扩增NY-ESO-1特异性TCR全长片段。上游引物:5'-GGAATTCATGGAGACCCTCT-3';下游引物:5'-ATAG TTTAGCGGCCGCCTAGCCTCTGGAA-3'。PCR反应条件:94℃预变性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，35个循环后72℃延伸5 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段(1 839 bp)。

1.5 流式检测电转后PBMC细胞表型

电转后24 h收集已电转GFP质粒的PBMC，用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达率。收集5×105个空电转PBMC，离心弃上清，用100μL PBS重悬细胞沉淀后，加入10μL FITC-anti-Vβ13.1充分混匀，避光染色20 min。收集ESO-TCR PBMC至两支无菌1.5 mL离心管，调整密度5×105个PBMC/管。离心弃上清后，加入100μL PBS重悬细胞。分别加入10μL混合荧光抗体CD3Percp/CD4FITC/CD8PE和10μL FITC-anti-Vβ13.1，充分混匀。避光染色20 min后，用3 mL PBS洗涤，离心弃上清。分别向细胞沉淀加入500μL 4%多聚甲醛，重悬固定。4℃避光保存，经流式细胞仪测定细胞表面标志CD3、CD4、CD8和 Vβ13.1的表达情况。为保证检测结果准确性，每次检测均用鼠IgG2b-FITC同型对照抗体做同型对照。按上述步骤操作，重复检测5次ESO-TCR PBMC细胞表面Vβ13.1表达情况。

1.6 ELISPOT检测IFN-γ分泌情况

96孔板中包被捕获抗体100μL/孔，4℃孵育过夜;扣出捕获抗体，PBS洗板后，每孔加入100μL封闭液阻断非特异性结合位点1 h;用无血清培养基分别重悬细胞。阳性对照组每孔为空电转 PBMC 1×104/100μL(含PHA 10 mg/L);阴性对照组每孔为ESO-TCR PBMC 1×104/100μL;非特异性对照组每孔为1×104个ESO-TCR PBMC细胞 +1×104个 flu-T2 细 胞/100μL，flu-T2 细 胞 为3×104个T2细胞与20μg flu多肽共培养4 h获得;空电转组每孔为1×104个空电转 PBMC细胞 +1×104个ESO-T2 细 胞/100μL，ESO-T2 细 胞为3×104个T2细胞与20μg NY-ESO-1b多肽共培养4h获得;实验组每孔为1×104个ESO-TCR PBMC细胞+1×104个ESO-T2细胞/100μL，ESO-T2细胞获取方法同上。以上各组均设3个复孔;放入细胞培养箱，培养19 h;用生物素标记的抗IFN-γ的单抗孵育2 h(37℃、5%CO2)。用0.05%Tween20-PBS冲洗4次，甩干后加显色液显色25 min，用去离子水冲洗，终止显色。干燥后读板计数。

1.7 细胞毒性实验

以本实验室前期构建的稳定表达NY-ESO-1阳性HepG2细胞为特异性靶细胞(简称T1)、NY-ESO-1阴性HepG2为非特异性靶细胞(简称T2)。靶细胞培养基为1640培养基(含10%人AB血清)，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。效应细胞为ESO-TCR PBMC(简称E1)、空电转PBMC(简称E2)。实验组效靶比(E1/T1)分别为:4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1;非特异性对照组效靶比(E2/T1)为4∶1;空电转组效靶比(E1/T2)为4∶1;背景对照组为:E1/T1=0∶1，E2/T2=0∶1;靶细胞接种浓度每孔为1×104/200μL，接种于仪器配套的E-Plate。每组均设3个复孔。靶细胞培养至对数生长期后按比例加入相应效应细胞，检测靶细胞CI值(Cell Index)，检测间隔为10 min，连续检测10 h。杀伤效率按下方公式计算得出:

1.8 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件对数据进行配对样本秩和检验分析。统计学显著性检验为双侧。

2 结果

2.1 p CDNA3.1-TCR质粒提取

质粒浓度1.18 mg/L，A值:1.73。

2.2 体外聚合酶链反应(PCR)扩增电转后PBMC特异性TCR基因片段

琼脂糖凝胶电泳(图1)可见1 839 bp处有明显条带。

图1 PBMC电转后PCR扩增TCRFig 1 Detection of TCR of transfered PBMC by PCR

2.3 流式细胞检测电转后PBMC细胞的表型

电转后细胞存活率为15% ～20%。电转后12～24 h可见荧光蛋白表达。电转效率约为15.28%(图2)。ESO-TCR PBMC中 CD8+T细胞占 27.6%，CD4+T细胞占14.5%。检测ESO-TCR PBMC细胞表面Vβ13.1表达率为27.84% ±1.46%，显著高于空电转PBMC的 2.48% ±0.36%(图3，P ＜0.05)。

2.4 电转后PBMC分泌IFN-γ的检测结果

ELISPOT检测两组细胞分泌IFN-γ情况。实验组细胞分泌IFN-γ的斑点数为(133.20±7.39)，明显多于空电转组的(4.71±0.82)(p＜0.05)。非特异性对照组斑点数为(24.80±5.50)，显著低于实验组而高于空电转组(p＜0.05)。

2.5 电转后PBMC特异性杀伤实验结果

按不同比例加入效应细胞后，培养10 h，效靶比(E/T)为4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1时，实验组(E1/T1)杀伤效率均明显高于效靶比为4∶1时非特异对照组(E2/T1)及空电转组(E1/T2)的杀伤效率(图4，P ＜0.05)。

3 讨论

针对NY-ESO-1抗原的过继性免疫治疗目前已进入临床试验阶段。最近有研究者以NY-ESO-1为靶标，使用TCR对自体T细胞进行基因修饰后，用其治疗恶性黑色素瘤及滑膜肉瘤患者。实验结果显示接受治疗的17名恶性黑色素瘤患者以及10名滑膜肉瘤患者中，各有8名产生了明显的临床应答，并且实验过程中未观察到该治疗方法对正常组织产生毒性作用。该临床试验研究结果证明T细胞介导的以NY-ESO-1作为靶标的靶向治疗能够作为一种有效的治疗途径［5］。本实验前期研究结果发现，NY-ESO-1在120例原发性肝癌患者中表达率为23.3%，且患者体内该抗原的表达情况与肝癌切除术后复发密切相关［6］。提高NY-ESO-1阳性肝癌患者体内T细胞别该抗原进而杀伤肿瘤细胞的能力，将有助于降低肝癌患者的复发率，延长患者生存期。

本实验通过优化电转的方式将NY-ESO-1特异性TCR基因电转至正常人PBMC中，显著提高了NY-ESO-1特异性TCR基因在人PBMC细胞表面的表达率。本研究发现:经NY-ESO-1b多肽递呈后，实验组ESO-TCR PBMC分泌IFN-γ的效率明显高于空电转组。IFN-γ由CD8+T细胞和CD4+T细胞分泌，能够聚集APCs并通过APCs吸引更多的T细胞，同时上调肿瘤细胞及携带肿瘤的APCs上MHCⅠ类及Ⅱ类分子的表达［7］。当肝细胞发生损伤时，IFN-γ能与肝脏非实质细胞表面的特异性受体结合，激活自身免疫反应及过继性免疫反应［8］。IFN-γ可通过促进肝细胞凋亡及诱导细胞分裂周期停滞两种途径抑制肝细胞过度增殖［9-11］。所以，转导NY-ESO-1特异性TCR至T淋巴细胞，提高细胞特异性分泌IFN-γ的效率将有助于抑制NY-ESO-1阳性肝脏肿瘤的生长。

总之，本实验通过电转方式成功将NY-ESO-1特异性TCR基因转导入正常人PBMC中，通过特异性抗原肽呈递提高了外周血淋巴细胞分泌IFN-γ的效率，同时提高了ESO-TCR PBMC对NY-ESO-1抗原阳性肝癌细胞的特异性杀伤效率。为今后进行TCR基因修饰T细胞的过继性免疫治疗提供了基础资料。

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