亚硒酸钠通过AMPK/mTOR通路调控白血病NB4细胞凋亡

段 婧，罗 慧，史可鉴，杨 洋，许彩民

(中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京协和医学院，北京100005)

白血病是一类由于造血干细胞异常引起的克隆性恶性血液疾病［1］。硒是具有抗癌作用的人体必需微量元素之一，大量证据表明，超营养剂量的硒能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡。亚硒酸钠是一种潜在的白血病治疗药物，但是硒化合物的抗癌机制，尤其是特异性杀伤肿瘤细胞的分子机制目前尚不清楚。本实验前期研究发现，亚硒酸钠可以通过多条通路诱导白血病细胞凋亡［2－4］。本实验主要探讨AMPK/mTOR通路在这个过程中所起的作用。AMPK是一种异源三聚体蛋白，由一个催化亚基(α)和两个调节亚基(β和γ)3个亚单位组成。本实验研究AMPKα亚基的苏氨酸172位磷酸化。AMPK能够重编程细胞的能量代谢，同时通过mTOR、P53 调控细胞凋亡与自噬［5－6］。AMPK 作为感受细胞能量的开关在细胞的代谢调控中起到十分重要的作用。现代观点认为肿瘤的发生与细胞代谢紊乱密切相关［7］。实验证据表明AMPK在许多肿瘤细胞中都是异常激活的［8－9］，它的磷酸化激活可以对细胞能量代谢过程的一些关键蛋白激酶如:mTOR、PI3K及SREBP-1等进行调控，进而对细胞的凋亡产生影响。本实验用AMPKα亚基的特异性激活剂AICAR和干扰序列对AMPK及其相关蛋白mTOR在亚硒酸钠诱导白血病NB4细胞凋亡的过程中所起的作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:NB4细胞系(中国协和医科大学药物研究所惠赠)，表达野生型功能性P53基因。

1.1.2 试剂与抗体:亚硒酸钠(Sigma-Aldrich公司);兔抗人AMPKα抗体、兔抗人p-P70S6K抗体和兔抗人p-mTOR抗体(Cell Signaling Technology公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);DharmaFECT 1转染试剂(Thermo Scientific公司);AMPKα1/2干扰序列(Santa Cruz公司sc-45312);Annexin V/PI染色试剂盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将NB4细胞培养于含10% 胎牛血清1640培养基内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。实验时采用处于对数生长期的细胞，实验起始浓度为4×105个/mL。

1.2.2 细胞处理:分别采用0、2、5、10和20μmol/L亚硒酸钠及20μmol/L亚硒酸钠处理NB4细胞0、3、6、12和24 h，提取细胞总蛋白。激活AMPK时分别采用1 mmol/L的AMPKα亚基的特异激活剂AICAR以及1 mmol/L的AICAR预处理1 h后用20μmol/L的亚硒酸钠处理NB4细胞;干扰AMPK时分别采用AMPKα1特异的siRNA和siRNA干扰过夜后再用20μmol/L的亚硒酸钠处理NB4细胞。激活和干扰处理后24 h提取细胞总蛋白，Western blot检测相关蛋白以及AnnexinV/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3 Western blot方法:收集细胞，用预冷PBS洗1次，RIPA裂解液裂解细胞，超声5 s，每个样品6次，离心收集上清液即为总蛋白溶液。用Bradford法测量蛋白含量，取等量蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，以含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭1 h，一抗孵育4℃过夜。TBST洗膜，用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育1 h，TBST洗膜后ECL显色发光检测相应条带。β-actin作为内参照。所有实验至少重复3次。

1.2.4 RNA干扰实验:1 mL无血清无双抗的RPMI1640培养基将NB4细胞稀释成106个/mL铺到12孔板中37℃，5%CO2预培养。在一个无RNA酶的离心管中用Opti-MEM将siRNA母液配成100μL 50 nmol/L的工作液，在另一个无RNA酶的离心管中用97μL Opti-MEM稀释3μL的DharmaFECT转染试剂。两管分别混匀静置5 min后，将两管混匀室温孵育20 min。将配制好的混合液加入含有1 mL Opti-MEM的培养基中。在转染6 h后，往培养板中加入新鲜培养基。培养24 h后用亚硒酸钠处理，再培养24 h后收集细胞，Western blot检测蛋白表达。

1.2.5 流式细胞术检测凋亡率:约106个细胞经过激活或干扰后，收集细胞，1 000×g离心5 min，冰冷PBS洗涤1次。收集约105个细胞用100μL含2μL Annexin V-FITC染料和0.1μL PI染料的Binding缓冲液将细胞悬浮，避光15 min，过筛后上机检测。

1.2.6 免疫共沉淀:约107个细胞经过硒处理24 h后，收集细胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min(r=8.5 cm)离心15 min收集蛋白上清;Bradford法对蛋白定量后，调蛋白浓度成一致;用相应一抗免疫沉淀目标蛋白，4℃旋转过夜;然后用25μL琼脂糖珠子捕获免疫沉淀复合物，4℃反应3 h;RIPA洗涤沉淀复合物3遍，3×SDS loading缓冲液重悬沉淀，煮沸后使蛋白变性;离心收集样品上清，－80℃保存或进一步用Western blot检测。

2 结果

2.1 亚硒酸钠对NB4细胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影响

亚硒酸钠处理NB4细胞后随着亚硒酸钠浓度增加、处理时间延长，AMPK蛋白的磷酸化水平上升(图1)。

2.2 亚硒酸钠对NB4细胞中mTOR及P70S6K蛋白磷酸化水平的影响

亚硒酸钠处理NB4细胞后随着亚硒酸钠浓度增加、处理时间延长，mTOR及P70S6K蛋白的磷酸化水平下调(图2)。

2.3 激活AMPK对亚硒酸钠处理后NB4细胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平以及细胞凋亡的影响

和对照组相比，亚硒酸钠、AICAR以及亚硒酸钠和 AICAR联用均能够明显激活 AMPK，抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相关分子PARP切割明显(图3A)。亚硒酸钠、AICAR以及亚硒酸钠和AICAR联用处理后细胞的凋亡率相比对照组均有明显上升(图3B)。

2.4 干扰AMPK对亚硒酸钠处理后NB4细胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平及细胞凋亡的影响

相比亚硒酸钠处理组，AMPKα1 siRNA以及亚硒酸钠和AMPKα1联用处理组，mTOR、P70S6K磷酸化水平有显著上升、凋亡相关分子PARP切割明显减弱(图4A)，AMPKα1 siRNA及亚硒酸钠和AMPKα1 siRNA联用处理后细胞的凋亡率相比亚硒酸钠处理组均有明显下降(图4B)。

图5 亚硒酸钠对NB4细胞中AMPK和mTOR相互作用的影响Fig 5 Effect of sodium selenite on interaction between AMPK and mTOR in NB4 leukemia cancer cells

2.5 AMPK和mTOR有相互作用

亚硒酸钠处理NB4细胞24 h后AMPK和mTOR之间的确存在直接的相互作用(图5)。

3 讨论

硒是一种具有潜在抗癌作用的微量元素。国内外研究结果证明，在某些含硒量高的地区，癌症发病率较低。本实验前期研究表明，在NB4细胞中亚硒酸钠通过抑制mTOR可以抑制自噬，进而促进凋亡［10］，动物模型也证明硒可以抑制肿瘤的生长［11］。

AMPK是能量代谢和自噬、凋亡调控中的重要分子［12］。在细胞内 AMPK被激活后可对 P53、mTOR等凋亡自噬中的关键调控分子进行磷酸化，进而对细胞的凋亡自噬进行调控［13－14］。推测AMPK作为mTOR的上游分子，通过抑制自噬促进了凋亡。

本研究采用不同浓度亚硒酸钠及不同时间处理NB4细胞后检测AMPK、mTOR以及P70S6K的磷酸化水平及其在调控凋亡过程中的作用。结果发现随着亚硒酸钠浓度的增大，处理时间的增长，AMPK的磷酸化水平显著增加，而mTOR以及P70S6K的磷酸化水平显著降低。用AMPK的激活剂AICAR处理NB4细胞24 h后，能够显著激活 AMPK、抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相关分子PARP切割明显增多;流式细胞结果也显示激活AMPK后细胞的凋亡率相比对照组均有明显上升。AICAR与亚硒酸钠对NB4细胞的类似影响提示亚硒酸钠可能通过激活AMPK、抑制mTOR从而促进NB4细胞凋亡。

干扰AMPK后NB4细胞中mTOR以及P70S6K的磷酸化水平相比对照组明显增加，表明AMPK的确对mTOR存在抑制作用;同时流式细胞分析数据表明和亚硒酸钠处理组相比，干扰AMPK后亚硒酸钠处理组的凋亡率有显著下降。以上结果表明，干扰AMPK可以减弱对mTOR的抑制，拮抗亚硒酸钠对NB4细胞凋亡的促进作用。

免疫共沉淀实验证明，AMPK和mTOR之间存在直接相互作用，提示亚硒酸钠引起的AMPK苏氨酸172位的磷酸化激活可能对mTOR的活性起到直接的负调控作用。

综上研究结果证明，亚硒酸钠可激活白血病NB4细胞中AMPKα，进而抑制mTOR以及P70S6K的磷酸化水平，从而促进NB4细胞凋亡，AMPK与mTOR之间的相互作用可能对它们协同调控NB4细胞凋亡起到了一定的作用。

［1］Bazarbachi A，Suarez F，Fields P，et al．How I treat adult T-cell leukemia/lymphoma［J］．Blood，2011，118:1736 －1745．

［2］Jiang Q，Wang Y，Li T，et al．Heat shock protein 90-mediated inactivation of nuclear factor-kB switches autophagy to apoptosis through becn1 transcriptional inhibition in selenite-induced NB4 cells［J］．Mol Bio Cell，2011，22:1167－1180．

［3］Han B，Wei W，Hua F，et al．Requirement for ERK activity in sodium selenite-induced apoptosis of acute promyelo-cytic leukemia-derived NB4 cells［J］．JBiochem Mol Biol，2007，40:196－204．

［4］Guan L，Huang F，Li Z，et al．P53 transcription-independent activity mediates selenite-induced acute promyelocytic leukemia NB4 cell apoptosis［J］．BMB Rep，2008，41:745－750．

［5］Luo Z，Zang M，Guo W．AMPK as a metabolic tumor suppressor:control of metabolism and cell growth［J］．Future Oncol，2010，6:457 －470．

［6］Gwinn DM，Shackelford DB，Egan DF，et al．AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint［J］．Mol Cell，2008，30:214 －226．

［7］Vander Heiden MG，Cantley LC，Thompson CB．Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation［J］．Science＇s STKE，2009，324:1029 －1033．

［8］Lee YK，Park SY，Kim YM，et al．Suppression of mTOR via Akt-dependent and-independent mechanisms in selenium-treated colon cancer cells:involvement of AMPKα1［J］．Carcinogenesis，2010，31:1092－1099．

［9］Shao J，Zhang A，Qin W，et al．AMP-activated protein kinase(AMPK)activation is involved in chrysin-induced growth inhibition and apoptosis in cultured A549 lung cancer cells［J］．Biochem Bioph Res Co，2012，423:448 －453．

［10］ Ren Y，Huang F，Liu Y，et al．Autophagy inhibition through PI3K/Akt increases apoptosis by sodium selenite in NB4 cells［J］．BMB Rep，2009，42:599 －604．

［11］Huang F，Nie C，Yang Y，et al．Selenite induces redoxdependent Bax activation and apoptosis in colorectal cancer cells［J］．Free Radical Med，2009，46:1186 －1196．

［12］Hardie DG，Ross FA，Hawley SA．AMPK:a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis［J］．Nat Rev Mol Cell Bio，2012，13:251－262．

［13］Jones RG，Plas DR，Kubek S，et al．AMP-activated protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint［J］．Mol Cell，2005，18:283 －293．

［14］Kimura N，Tokunaga C，Dalal S，et al．A possible linkage between AMP‐activated protein kinase(AMPK)and mammalian target of rapamycin(mTOR)signalling pathway［J］．Genes Cells，2003，8:65－79．