新型食物不耐受sIgG定量检测方法的构建*

相 平 孙 静 周宇捷 任 杰 刘堂喻哼 李会强△

近年来，食物不耐受现象越来越普遍，已成为国内、外研究的重点[1-2]。食物不耐受的诊断主要依靠病史、双盲安慰剂对照试验和体外过敏原特异性免疫球蛋白G（sIgG）检测[3]。与食物过敏性疾病相比，食物不耐受引起的临床表现不典型，依靠病史很难做出明确诊断；双盲安慰剂对照试验因程序复杂、耗时长未在国内广泛使用。血清sIgG具有检测方法简单、高通量等优点，备受临床重视和欢迎。检测血清sIgG作为确认不耐受食物的重要依据，同时监测血清sIgG的变化可评价脱敏治疗的效果。当前检测血清sIgG主要采用酶联免疫吸附试验（ELISA）[4-5]。临床广泛使用的试剂盒是由美国BIOMERICA公司生产的。此试剂是以14种食物为组合的固定模式，缺乏灵活性，不适于患者个性化检测，更不适合已确诊患者脱敏治疗时对单一抗体的动态监测。因鸡蛋被认为是引发食物不耐受反应最常见的食物之一[6]，故本研究以鸡蛋为例，尝试利用生物素-链酶亲和素系统，建立一种新型的鸡蛋不耐受sIgG定量检测方法，以期为今后研制“个性化”随机组合食物过敏原sIgG检测试剂盒奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2012年10月—2013年7月于天津市人民医院行食物过敏原sIgG检测的门诊和住院患者173例。其中，符合临床现用食物不耐受sIgG检测试剂盒（美国BIOMERI⁃CA公司）诊断和分级标准的阳性患者有95例，男40例，女55例，平均年龄（45.22±14.34）岁，其血清sIgG均大于50 U/mL；另择健康体检者78例为阴性对照，男29例，女49例，平均年龄（38.66±10.84）岁，其血清sIgG均小于50 U/mL。

1.2 材料及仪器 生物素化牛血清白蛋白（biotinylated bo⁃vine serum albumin,Bio-BSA，购自Equitech-Bio公司，货号：BAH67-0050），链霉亲和素（购自PIERCE公司，货号：21122），长臂活化生物素（Sulfo-NHS-LC-Biotin，Thermo Piece，货号：21335），辣根过氧化物酶（HRP）-抗人IgG（购自SouthernBiotech，货号：6140-05），卵类黏蛋白（Ovomucoid，OVM）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）、卵转铁蛋白（Ovotrans⁃ferrin，OVT）、溶菌酶（Lysozyme，Ly）均购自美国Sigma公司，货号分别为T 2011-250 MG、A 5503-1 G、C 0755-100 MG、L 6876-1 G；96孔酶标反应板（美国Costar公司）。低温高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER OptimaTML-80 XP）、酶标分析仪（Bio-Tek公司EXL-800型）。

1.3 制备生物素化的食物蛋白 取新鲜鸡蛋2枚，分离蛋清和蛋黄，采用丙酮沉淀法制备蛋清提取液[7]。按1∶5的体积比加入-20℃预冷丙酮，于4℃去脂24 h。然后3 000 r/min离心30 min，将沉淀通风挥干后称质量。按8 mL/g溶于0.01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）中，于4℃提取24 h。最后离心，收集上清液，即为蛋清粗提液。测定溶液的浓度，分装后-20℃保存。蛋黄提取液的制备方法与此相同。

鸡蛋抗原的生物素标记方法参照文献[8]并略作调整。用0.1 mol/L NaHCO3（pH 9.5）溶液配制1 g/L的待偶联抗原。用二甲基甲酰胺配制20 g/L的生物素。按一定比例计算生物素的用量，然后将生物素缓慢、逐滴加入待偶联抗原溶液中，边滴加边搅拌。全加入后室温搅拌1 h。在4℃下用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）溶液透析24 h，充分除去游离生物素。分装贮存，4℃放置备用。

1.4 生物素-链酶亲和素化酶标反应板的制备 依据生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素酶标反应板制备方法（专利号：201110068782.9），制备生物素-链酶亲和素化酶标反应板[9]。取聚苯乙烯微孔板每孔加150 μL生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液，室温过夜。洗板2次，每次10 min。每孔加150 μL链霉亲和素包被缓冲液，室温2 h。洗板2次，加入封闭液，4℃过夜。真空干燥后备用。

1.5 生物素化抗原的选择 随机抽取10例阴性血清和10例阳性血清，分别混合制备阴性和阳性混合血清。采用本实验建立的方法测定混合血清中sIgG的含量。每个标本做复孔，计算其平均值，选择阳性血清吸光度值（AP）与阴性血清吸光度值（AN）比值最大的生物素化抗原，作为本方法所选用的抗原。

1.6 生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素ELISA方法的建立 取制备的生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素酶标反应板1个，每孔加入25 μL待测血清（预先1∶20倍稀释），然后加入100 μL生物素抗原，37℃温育1 h；洗板5次，拍干；加入HRP-抗人IgG 125 μL，37 ℃温育30 min；再洗板5次，拍干；在反应孔中加入底物A、B各1滴，室温反应10 min；在反应孔中加终止液1滴，用Bio-Tek EXL-800酶标仪测定在450 nm处的吸光度（A）值。用方阵滴定法，即不同浓度生物素化抗原和HRP-抗人IgG进行组合，以标准曲线拟合及AP/AN最大值作为评价标准，选择生物素化抗原和HRP-抗人IgG的最佳稀释度。

1.7 sIgG定量标准曲线的建立 将食物不耐受sIgG的强阳性混合血清稀释成不同浓度，以临床现用食物过敏原sIgG检测试剂盒（美国BIOMERICA公司）检测，分别以0、50、100、200、400 U/mL作为标准品，用以上得到的最优反应条件检测其450 nm处A值，根据检测结果绘制标准曲线。

1.8 方法学鉴定实验

1.8.1 精密度 取高、中、低值浓度的血清，在同一次实验中检测sIgG的含量，每个样本平行做10次，计算批内变异系数（CV）；在不同实验日检测高、中、低值样本中sIgG的含量，每个样本平行做10次，计算批间CV。

1.8.2 特异性 随机抽取13例其他食物sIgG阳性、鸡蛋sIgG阴性的血清，用标准品稀释液稀释，采用本实验建立的方法测定A值，计算与其他食物sIgG的交叉反应情况。

1.8.3 正常参考值上限的确定 选取50例正常人血清，用本实验方法测定鸡蛋sIgG的浓度，计算A值的平均值及标准差，以标准曲线反算出平均值加2倍标准差所对应的浓度值即为正常人鸡蛋sIgG参考值上限。

1.8.4 与临床现用食物不耐受sIgG检测试剂盒的比较 随机抽取20例临床标本，分别用本实验建立的方法和临床现用食物不耐受sIgG检测试剂盒测定鸡蛋sIgG的含量，采用相关性分析对2种检测方法的测定结果进行比较。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，相关分析采用直线相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物素化抗原的选择 生物素化蛋清提取物（Bio-蛋清）的AP/AN值最大（均P＜0.05），A值在酶标仪的检测范围内，能将阴阳性血清区分开，因此将Bio-蛋清作为本方法所选用抗原，见表1。

Table 1 The choice of biotin allergens表1 生物素化抗原的选择 （x±s）

2.2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最佳工作浓度的确定 Bio-蛋清提取物的最适稀释比例是1∶2 000，酶标抗体的最适稀释比例是1∶12 000，此时的AP/AN值最大，见表2。

Table 2 The best concentration of biotinylation egg white and HRP-anti human IgG表2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最适浓度的方阵滴定结果

2.3 sIgG定量标准曲线的建立 以sIgG的浓度为横坐标，以A值为纵坐标，用Logistic曲线拟合（四参数）绘制标准曲线，其剂量-反应曲线见图1。

Figure 1 Standard curve for specific IgG图1 血清sIgG标准曲线

2.3 精密度检测 高、中、低浓度血清的批内及批间CV均小于10%，说明本方法具有良好的重复性，见表3。

Table 3 Within-run and between-run of different serum-concentrations表3 不同浓度血清的批内及批间变异

2.4 特异性 与蟹不耐受患者血清的交叉反率为7.61%，与牛、羊奶不耐受患者血清的交叉反应率为1.33%，与蘑菇、鸡油菌、牛肝菌不耐受患者血清的交叉反应率为0.17%。

2.5 正常参考值上限 结果呈正态分布，正常人sIgG参考值上限为50 U/mL。

2.6 与临床现用食物不耐受sIgG检测试剂盒的比较 以临床现用食物不耐受sIgG检测试剂盒的测定值作为横坐标，以本实验建立方法的测定值为纵坐标，绘制散点图，对两种方法的测定值进行相关性分析。结果显示本实验建立的方法与临床现用食物不耐受sIgG检测法有较好的相关性，回归方程为=0.977X+8.45，r=0.961，见图2。

Figure 2 Linear correlation between biotin-avidin ELISA and current clinical test for sIgG图2 生物素-亲和素ELISA法与临床现用sIgG检测法的相关性

3 讨论

食物不耐受的临床表现主要有腹泻、皮肤反应、头痛、哮喘等，其与多种慢性病有关，可累及消化、皮肤、神经、心血管等全身多个系统，其中以消化系统最为常见[10]。消化系统疾病尤其是慢性腹泻、炎症性肠病、慢性胃炎等出现食物不耐受的比例达93.3%，且同时对2种以上的食物不耐受的比例高达90%[11-12]。有研究表明，蛋清或蛋黄、蟹、牛奶是最主要的常见不耐受食物[13]。然而，由于其具有起病隐匿、涉及食物较多、诊断困难的特点，患者难以自我发现敏感食物。如不及时治疗，这种免疫损伤将会不断积累，引发一系列慢性症状或疾病，给患者带来长期困扰。

目前国内用于定量测定食物sIgG含量的国产试剂盒较少，主要依赖国外进口。临床广泛使用的试剂盒是由美国BIOMERICA公司生产的，此种试剂由厂家预先将14种食物蛋白包被于微孔板表面，其检测食物种类的组合模式无法改变，缺乏灵活性，更不适合已确诊患者脱敏治疗时对单一抗体的动态监测，造成多余的检测和漏检，同时会增加检测成本，不易在基层医疗机构推广使用。

本文引入生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素-生物素化抗原间接包被ELISA法检测食物不耐受sIgG。由于链霉亲和素对生物素具有高度亲和力（亲和常数为1×1015/mol），与生物素结合后形成非常稳定的复合物，很难解离。因此，可以实现抗原的即时包被。一方面，牛血清白蛋白来源方便、包被方式简单、稳定性好，保留了抗原活性，提高抗原利用效率。另一方面，有研究表明，通过这种间接包被模式可最大限度减少包被抗体的空间位阻效应，提高抗体的利用效率，降低实验成本[14]。这种间接包被的技术，已被广泛应用于多种检测指标，如妊娠相关蛋白A、人绒毛膜促性腺激素、抗甲状腺过氧化物酶抗体[9,15-16]等并取得较好效果。

本实验以鸡蛋为例，利用生物素化牛血清白蛋白-链酶亲和素-生物素化抗原间接包被模式检测血清中sIgG浓度。研究显示，此种新型酶联免疫模式具有较好的精密度和特异性。本方法与美国BIO⁃MERICA公司生产的试剂盒具有较好的相关性，可用于检测食物不耐受sIgG含量。食物不耐受涉及的种类繁多，对于其他不耐受食物的新型检测方法还有待推广和改进。在试剂盒进一步优化和广泛验证后，就可以根据患者需要选择疑似不耐受食物，实现个性化检测，相当于从“套餐式”改进为“订单式”，具有十分重要的意义。了解食物不耐受现象，判断产生不耐受的食物品种，通过针对性的禁食或少食不耐受食物可以有效地改善症状，控制疾病，改善健康状况，从而避免不耐受食物造成的不良影响，遏制疾病发生和发展。

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