一株水貂源乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究*

魏亚松，刘 坤，温建新*，邹 玲

(1.青岛农业大学 动物科技学院，山东 青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032)

近年来，水貂等小型毛皮动物消化道菌群的研究已成为一个重要的新课题。但目前国内对动物消化道菌群的研究报道较少，尤其是对水貂肠道菌群的研究未见报道。其中，乳酸菌作为动物肠道中的优势菌群之一，其对动物的有益作用已被许多研究结果所证实[1]。乳酸杆菌是仔猪肠道正常微生物区系中的优势菌群，可利用糖类发酵产生大量乳酸、乙酸及其他挥发性脂肪酸，对维持仔猪肠道微生物区系平衡和消化机能起着重要作用[2-3]。市售乳酸杆菌菌株大部分是从人和哺乳动物肠道中或土壤中分离得到的。寄主的遗传特性和环境影响肠道菌群结构和组成，寄主和肠道菌之间存在着相互选择、相互依赖的关系，因而一种适于某类动物的微生态制剂不一定适于另一类动物。要保持定植能力，活菌制剂的生产菌种应从同种属宿主分离。鉴于此,本研究拟从健康水貂肠道中分离筛选出耐酸、抑菌效果好、安全等特点的菌株，为开发应用于防治水貂腹泻性疾病的微生态制剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 健康成年丹麦红眼母貂1只，来自青岛某水貂养殖场。

1.1.2 主要试剂 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基购自北京奥博星生物技术公司，莫匹罗星锂盐改良MRS培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司、糖醇发酵管(葡、麦、蔗、乳、甘、木、果、山、七叶苷等)、药敏纸片购杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3 DNA提取和16S rRNA基因扩增所用试剂 PBS缓冲液，TE缓冲液，细菌裂解液，Premixed Taq(incl dye)、DL 2 000 DNA Marker购自北京托普赛生物有限公司，电泳级琼脂糖Agarose Regular购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 样品的采集与处理 分别取各段肠粘膜和粪便样品1 g，分别置于含生理盐水9 mL三角瓶，振荡混匀30 min，制成匀浆后，静置15 min，制成10-1的稀释液。

1.2.2 分离纯化 取样品的稀释液100 μL涂布于含有碳酸钙的MRS培养基上，厌氧37 ℃培养24 h。挑取有溶钙圈的菌落，进行革兰氏染色镜检。疑似阳性的菌落接种到莫匹罗星锂盐改良MRS培养基中纯化培养。

1.2.3 生化试验鉴定 按常规方法[4-5]对分离的菌株进行过氧化氢酶试验，氧化酶试验、KOH试验，吲哚试验、硫化氢试验、糖醇发酵试验、MR试验、VP试验、尿素酶试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、明胶液化试验及运动力试验等。

1.2.4 16S rRNA基因片段的序列分析 将分离的菌株接种于5 mL营养肉汤中培养，取4.5 mL菌液12 000 r/min离心2 min，参考文献[6]的方法提取DNA。

参考相关文献[7-8]，由上海生工生物工程有限公司合成了一对为乳酸杆菌属特异性引物(Lac16S正向371 5'-GCAGTAGGGAATCTTCCACA-3'，Lac16S反向593 5'-GCTTTA CGCCCAATAAATC-3'，扩增片断长度为223 bp)。

PCR反应体系：Premixed Taq 25 μL，正反向引物各加1 μL，DNA模板2 μL，补ddH2O 至体积为50 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s变性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，循环35 次；72 ℃ 5 min延伸。取5 μL PCR产物于1.0 %琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)电泳后在凝胶成像仪中观察扩增结果。

PCR产物经试剂盒纯化后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。采用BLAST与GenBank 数据库中已收录的乳酸杆菌属16S rRNA的序列比对，并使用MegAlian中的Clustal X Method进行同源性比较[9]。

1.2.5 耐酸试验 调节营养肉汤pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分别装入试管中，每管5 mL。将菌株液体培养物10 μL接入，37 ℃ 培养24 h，观察菌株生长情况[10-11]。

1.2.6 生长曲线及产酸试验 将筛选出的乳酸菌接种于盛有MRS液体培养基(接种量为1∶50)的三角瓶中，37 ℃，200 r/min 培养48 h。其中每隔2 h 取样于紫外分光光度计测定菌液的OD值(600 nm) 和pH，并绘制曲线[12-14]。用未接种的培养基作空白对照。

1.2.7 药敏试验 采用纸片扩散试验法。将乳酸菌悬液稀释至108 cfu/mL后取100 uL涂布于MRS培养基上，用灭菌的镊子将药敏片贴到培养基表面，轻轻压实。将培养基置于37 ℃培养24 h，测定药敏圈直径[15]。

1.2.8 抑菌试验 将致病性大肠杆菌和沙门氏菌分别接种于营养肉汤中，37 ℃，180 r/min过夜培养后，稀释菌液浓度至0.5个麦氏比浊单位，将已灭菌的普通培养基加热到完全融化，倒在培养皿内(每皿15 mL)，待其凝固。此外，将融化的普通培养基冷却到50 ℃左右加入致病菌株，将混有菌的培养基5 mL加到已凝固的培养基上待其凝固。然后以无菌操作在培养基表面垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入乳酸菌发酵液[16-17]。置于37 ℃培养16～18 h，然后用测量抑菌圈直径，计算其平均值。

1.2.9 安全性试验 选取体重18～22 g的昆明系小白鼠10只，随机分组，每组5只。按3.6×108CFU/mL的剂量对空腹8 h后的试验小鼠每天每次经口灌胃0.3 mL，同时设空白对照组。每天观察和记录，14 d结束试验后，剖检观察内脏及其它组织器官有无变化[18]。

2 结 果

2.1 菌落形态及镜检结果

菌落形态为中央凸起、边缘整齐、黄色或白色半透明状菌落。镜检为革兰氏阳性菌，菌体形态为杆状，多数呈链条状排列(如图1)，命名为RSJ。

2.2 生化试验鉴定结果

分离菌的触酶试验、吲哚试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验等皆为阴性(见表1)，根据RSJ菌的菌落、镜检形态和生化试验，参照文献[19-20]初步鉴定为乳酸杆菌属(Lactobacillus)。

图1 RSJ的菌落形态与革兰染色镜检(×1000)Fig.1 The colonial morphology, Gram staining of RSJ

2.3 PCR鉴定结果

用乳酸杆菌属特异性引物对菌株RSJ进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在223 bp处有特异性条带(图2)。

将分离的RSJ菌株的测序结果与其他17个从GenBank获取的乳酸杆菌属的核酸序列进行同源性比较。结果显示比对的几个菌株的同源性在91.2%～94.7%之间(图3)，RSJ菌株被鉴定为乳酸杆菌属。

2.4 耐酸试验结果

对RSJ菌株进行不同pH生长情况试验，判定试验结果标准是依据营养肉汤培养基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，摇动呈浑浊状，说明菌株在此培养条件下能够进行繁殖生长。结果表明，pH 2.0和3.0时，培养液摇匀后清澈，菌株在此pH基本不生长；pH 4.0时，培养液微混，菌株生长，但生长不好；pH 5.0和6.0时，培养液底部的有白色沉淀，摇匀后浑浊，菌株生长良好(图4)。

表1 RSJ的生化试验鉴定结果Table 1 The biochemical test results of RSJ

2.5 生长曲线和产酸试验

由图5看出，菌株RSJ在6 h开始进入对数期，前18 h菌株繁殖较快，OD600值持续生长，此时pH急速下降；从18～36 h，OD600值趋于平稳在1.670，pH趋于3.98，菌株维持在稳定期。

图2 菌株RSJ的16S rRNA 基因PCR 扩增结果Fig.2 The PCR amplified result of 16 s rRNA genes of Strain RSJ

图3 RSJ与其他菌株核酸序列的同源性比较结果Fig.3 The nucleic acid sequence homology comparison results of RSJ with other strains

图4 菌株RSJ的耐酸试验结果0.不接菌对照；2-6.不同pH培养基培养；7.接菌对照Fig.4 The acid test results of Strain RSJ0.No adding bacterial control; 2-6. Growth condtion in the different pH value broth culture;7. Adding bacterial control

2.6 药敏试验结果

用标准敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)作为质控菌，试验菌对抗生素的药敏性参照WHO提供的NCCLS的标准进行判断。对菌株进行了药敏试验，得到菌株对16种抗生素的药敏结果见表2。由表2知，菌株RSJ对青霉素、庆大霉素和环丙沙星等有一定的耐药性，其中对青霉素和环丙沙星的耐药性较强，对其余抗生素则表现为敏感。

2.7 抑菌试验结果

菌株RSJ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为8.3 mm，对大肠杆菌的抑菌圈为9.5 mm。

图5 菌株RSJ的生长曲线和产酸曲线Fig.5 The growth curve and acid yield curve of strain RSJ

2.8 安全性试验结果

经14 d灌服观察，小鼠生长状况良好，无死亡现象；剖检内脏组织器官无肉眼可见异常变化，说明菌株RSJ对小鼠无毒性。

3 讨 论

使用益生菌，首要问题是要考虑其定植性，活菌在体内定植是极为复杂的，具有宿主种属特异性。所以，筛选菌种时，应尽量选用来自该动物属宿主分离的正常菌群，这样菌株进入动物体内才较易存活，并能与致病菌抢夺附着点，具有很强的竞争优势。本试验采取健康成年母貂的新鲜肠粘膜和粪便，利用改良MRS培养基进行培养，通过形态特征、生理生化反应，结合16S rRNA分子生物学鉴定，鉴定出1株乳酸杆菌RSJ，并对RSJ菌株的生长情况和安全性等生物特性进行了研究。

表2 RSJ的药敏试验结果Table 2 The drug susceptibility test results of strains RSJ

注：R.耐药；M.中敏；S.敏感。

Note: R.resistance; M.moderate sensitive; S. sensitive.

传统的细菌鉴定方法试验周期长、工作量大、试验结果依赖人的主观判断。近年来，逐步建立起来的16S rRNA序列分析方法，通过提取样品中微生物的总DNA，直接从核酸水平对样品进行分析研究，为细菌的分类、鉴定提供了新的研究方法[21]。据孙晓雯等[22]报道，从猪粪便中分离得到一株新饲用乳杆菌，对其16S rDNA基因进行了测序并进行BLAST比对，和16S rDNA序列分析鉴定为约氏乳杆菌。陈丽园等[23]通过对菌体形态特征、菌落特征和生理生化特性的分析，最终将1 株抗鸡沙门氏菌的乳酸菌归类为乳酸乳杆菌亚军。

从水貂体内分离到的菌种制成微生态制剂对促进水貂的生长会有较为明显的效果[12]。本试验分离的菌株来自健康的水貂肠道，理论上讲，能够很好地适应水貂肠道。本试验只对乳酸杆菌进行了属的鉴定，还需要对其进行种鉴定，以及对其在水貂上的安全性试验以及效果等方面有待于进一步研究。

4 结 论

从水貂肠道分离的1株优势菌株(RSJ)，为乳酸杆菌属。RSJ在10 h进入对数期，前22 h菌株繁殖较快，pH急速下降；22～36 h，菌株维持在稳定期；其对青霉素和环丙沙星的耐药性较强；对小白鼠安全无毒，且对酸环境有一定的耐受性，其代谢产物对致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，具备了益生菌的基本条件。

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