清瘟败毒颗粒对鸡免疫的影响*

郭时金，徐倩倩，张志美，王艳萍，张 颖，付石军，沈志强*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600； 2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600)

清瘟败毒饮是清代著名温病学家余师愚所创制的名方，载于其所著的《疫疹一得》一书中。处方由生石膏、小生地、乌犀角、真川连、栀子、桔梗、黄芩、知母、赤芍、玄参、连翘、甘草、丹皮、鲜竹叶共十四味中药煎煮而成，药性专一，作用全面，功在清热解毒，泻火凉血。现代研究已报道，清瘟败毒饮具有抑制早期脓毒症患者过度免疫应答、减少过度免疫应答对机体自身的损害[1]、改善细胞免疫水平、有较强的抑菌作用。清瘟败毒饮对鸡白痢、猪高致病性蓝耳病[2-5]有良好地防治效果。清瘟败毒颗粒是在清瘟败毒饮基础上对其中主要成分进行单独提取，并在此基础上通过科学工艺制备的颗粒剂。本研究拟从清瘟败毒颗粒对鸡的抗体效价水平、淋巴细胞转化和免疫器官指数的影响进行系统的研究，为其临床及生产应用提供理论依据及实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物

30日龄健康非免疫海蓝白公鸡(山东农业科学院家禽研究所提供)。海蓝白基础日粮，由山东省农业科学院家禽研究所饲料厂提供。

1.2 药物

清瘟败毒颗粒药物，由山东绿都安特动物药业有限公司生产，规格：200 g/包，1.3 g生药/g颗粒。批号为20120210。新城疫活疫苗Cloe30，由山东绿都生物科技有限公司提供。

1.3 试剂和设备

试剂：RPMI1640 营养液、ConA(Sigma 公司)；10%小牛血清(Hyclone 公司)；MTT(AM-RESCO 公司)；肝素钠(北京奥博星生物技术责任有限公司)；淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)；SDS(Sigma 公司)。

设备：倒置显微镜(Nikon 公司)；全自动酶标仪(美国宝特)；CO2培养箱(Heraeus 公司)。

1.4 试验方法

海蓝白公鸡90只，随机分为3组，每组30只，自由饮水和采食，试验组分别为清瘟败毒颗粒组、对照药物组(左旋咪唑)、空白对照组。清瘟败毒颗粒组按鸡0.5 g/L自由饮水3 d，对照药物组按1%自由饮水3 d，空白对照组自由饮用自来水，不给药。处理3 d 后用2羽份/只Cloe30，点眼、滴鼻。

于免疫0、7、14、21、28 d，各组随机抽取10 只鸡，翼下静脉无菌采血，分离血清，用于测定鸡新城疫抗体，按照文献报道方法进行HI 效价检测[6]。

按文献报道方法进行淋巴细胞转化测定[7-8]：无菌采鸡心脏肝素抗凝血10 mL，加入10 mL RPMI 1640 完全营养液(含10%小牛血清)，混匀后等分为5 份。将血样沿离心管管壁缓慢加于4 mL淋巴细胞分离液上层，离心(2 000 r/min，20min)，吸取淋巴细胞层，反复3次。用台盼蓝拒染法检测细胞活率，同时淋巴细胞计数，用无血清RPMI1640 完全营养液调整细胞浓度为4×106个/mL。

淋巴细胞培养及检测：取RPMI1640营养液(含10% 小牛血清，5 g/mL ConA)加入无菌96孔细胞培养板，每孔50 μL；每孔再加4×106个/mL淋巴细胞悬液50 μL，即每孔100 μL，以无细胞RPMI1640营养液调零。96孔细胞培养板置于CO2培养箱(39 ℃、5% CO2、饱和湿度)培养66 h，每孔加浓度为5 mg/mL MTT 15 μL，继续培养4 h，然后每孔加10% SDS-0.01 mol/L HCl 100 μL，继续培养2 h，室温放置5 min，紫外可见分光光度计测定OD570nm的吸光值。

免疫器官指数的测定：于免疫28 d后，各组随机抽取10 只鸡，捕杀，采用器官重量法进行腔上囊、胸腺和脾脏等免疫器官指数的测定。

1.5 数据分析

所有数据用平均值± 标准差表示，应用SPSS 17.0统计分析软件对试验数据进行单变量方差分析，以最小显著差数法(LSD)进行差异显著性检验。

2 结 果

2.1 鸡新城疫抗体效价检测

由表1可知，清瘟败毒颗粒组7、14、21、28 d新城疫抗体效价均高于阳性对照药物组和空白对照组，差异显著(P<0.05)；对照药物组比空白对照组新城疫抗体效价稍有升高，但差异不显著(P>0.05)，说明清瘟败毒颗粒对鸡的体液免疫有增强作用，且明显强于对照药物。

2.2 外周血T细胞测定

提高淋巴细胞转化率方面，清瘟败毒颗粒组与对照药物组比较，两组均能提高转化率，差异不显著(P>0.05)，但与空白对照组相比，差异显著(P<0.05)，说明清瘟败毒颗粒具有增强细胞免疫功能，提高抗病能力(见表2)。

2.3 免疫器官指数的测定

由表3可知，清瘟败毒颗粒组腔上囊、脾脏、胸腺指数均高于空白对照组与对照药物组，且差异显著(P<0.05)，与2.1和2.2的结果是一致的，即具有较强的免疫增强功能。

表1 清瘟败毒颗粒对鸡新城疫抗体效价的影响Table 1 Influence of Qingwen Baidu Granules to New castle disease antibody titer of fowl

注：同项同列数据右上角字母者相同为差异不显著(P>0.05)；字母者不同为差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Values with superscripts in the same column mean inignificant difference (P>0.05); while those with different ones mean significant difference (P<0.05).The same below.

表2 清瘟败毒颗粒对鸡T细胞总数的影响(OD570 nm的吸光值)Table 2 Influence of Qingwen Baidu Granules to totle T-cellular score of fowl

表3 清瘟败毒颗粒对鸡免疫器官指数的影响Table 3 Influence of Qingwen Baidu Granules to immune organ index of fowl %

3 讨 论

机体血清抗体水平的高低是评估体液免疫水平的重要指标之一，通常血清抗体水平越高说明机体对该种疫病的抵抗力越强，清瘟败毒颗粒对鸡新城疫抗体效价有显著的提高作用，28 d后抗体效价下降较缓慢，能够延长在体内的时间。T 淋巴细胞主要介导细胞免疫，T 淋巴细胞的增殖是评价机体细胞免疫功能的重要指标。采用MTT法测得的OD 值与淋巴细胞增殖率呈正比。本研究结果表明，服用清瘟败毒颗粒能够显著提高淋巴细胞转化率。胸腺、法氏囊和脾脏是禽类重要的免疫器官，它们重量的增加是由其自身细胞生长发育和分裂增殖所致，因此免疫器官重量是评价机体免疫机能的重要指标，而免疫器官指数提高又是免疫系统成熟的标志。在本试验中，对鸡腔上囊、脾脏和胸腺等免疫指数的测定结果表明，清瘟败毒颗粒可显著提高鸡免疫器官指数，促进其发育，从而增强机体的特异性与非特异性免疫功能。研究表明，桔梗中的桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠具有免疫增强调节作用[9]；玄参可以显著增强小鼠血清抗体水平；甘草多糖能够提高抗体生成细胞水平和胸腺、脾脏指数，增强巨噬细胞的吞噬活性，从而增强机体免疫[10]；丹皮多糖有效部位PSM2b可增强T淋巴细胞功能，并对巨噬细胞具有激活作用[11]，但清瘟败毒颗粒通过单独某种药物或者多种药物相互作用实现免疫增强作用还需要进一步研究。

总之，清瘟败毒颗粒能显著提高仔鸡血清新鸡城疫抗体水平，促进外周血淋巴细胞的增殖，增强机体的细胞免疫功能，提高仔鸡早期免疫器官指数，说明清瘟败毒颗粒可显著促进仔鸡免疫器官发育，提高仔鸡免疫机能。

参考文献:

[1] 冷建春, 王卫星. 清瘟败毒饮治疗脓毒症临床疗效及对部分血清免疫学指标的影响[J]. 中国中医急症，2010，19(9):1 483-1 484.

[2] 李绍民, 于立丽. 清瘟败毒饮治疗肾综合症出血热发热期作用机理的探讨[J].黑龙江医药科学，2010，33(6):23-24.

[3] 宁官保, 郑明学, 温伟业. 畜禽清瘟败毒散和泻痢康的体外抑菌试验[J]. 中国兽医杂志，1999，33(2):56-58.

[4] 宁官保, 郑明学, 温伟业. 畜禽清瘟败毒散对鸡白痢的防治效果[J]. 中国兽医杂志，1998，12(24)：34.

[5] 唐耀平, 周双海. 三种中药对高致病性猪蓝耳病的防治效果试验[J]. 畜禽业，2008(3):53-54.

[6] 崔治中. 兽医免疫学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006：23-25.

[7] 杨发龙, 岳 华, 罗 薇, 等. MTT 法检测鸡外周血淋巴细胞增殖性反应的最佳条件探讨[J]. 西南民族学院学报, 2002, 28(2): 214-215.

[8] 郑铁锁, 王贵平, 胡元亮, 等. 复方中草药对雏鸡外周血T 淋巴细胞增殖的影响[J]. 畜牧与兽医, 2010, 42(2): 110-111.

[9] 贾 林, 陆金健, 周文雅, 等. 桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节[J]. 食品与机械, 2012, 28(3): 112-114.

[10] 胡 菁, 敖明章, 崔永明. 甘草多糖的抗肿瘤活性及对免疫功能的影响[J]. 天然产物研究与开发,2008,20(5):911-913.

[11] 戴 玲, 赵帜平, 沈业寿, 等. 丹皮多糖PSM2b体外对小鼠免疫细胞功能的影响[J]. 激光生物学报, 2001, 10(1): 48-50.