《金匮》肾气丸对阿尔茨海默病模型大鼠额叶皮质神经元NT-3表达的影响*

魏良浩 潘 庆 张跃明

（1.浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012）

阿尔茨海默病（AD）也称老年性痴呆症，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，主要障碍表现在记忆上，患者关于自己记忆能力的知识受损，从而不能及时更新个人数据库，被认为与额叶有关［1］。神经营养因子-3（NT-3）广泛分布在中枢神经系统内，具有阻止胚胎期和出生后运动神经元细胞死亡、支持感觉和运动神经元的存活等功能，给记忆障碍的老龄鼠注射NT-3，有助于其记忆能力的恢复。在阿尔茨海默病中NT-3 Gly（63）～Glu突变明显高于正常人［2］。因此，本实验通过对AD大鼠额叶皮质的NT-3阳性细胞数进行分析，研究《金匮》肾气丸对AD的防治作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性清洁级SD大鼠30只，体质量（250±20）g，购于浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 药物与试剂 《金匮》肾气丸（生地黄24 g，山茱萸肉 12 g，山药 12 g，牡丹皮 9 g，泽泻 9 g，桂枝 12 g，淡附子12 g）购于浙江中医药大学第一门诊部，煎成3 g/mL药液，放入无菌容器中4℃保存备用。Aβ25-35peptide（北京博奥森生物技术公司），一抗NT-3（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1293），即用型SP试剂盒 （上海长岛生物技术有限公司，编号：D-3005），DAB显色试剂盒 （上海长岛生物技术有限公司，编号：FL-6001）。

1.3 分组与造模 适应性饲养1周后，将大鼠随机分3组：正常对照组，AD模型组，中药治疗组，每组10只。模型组及中药治疗组大鼠用2%的戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，固定在脑立体定位仪上，精确定位右侧海马CA2区 （前囟后 4.2 mm，右侧2 mm，深2.6 mm），头顶备皮，切开皮肤，在颅骨上用牙钻打孔至海马区注射点，用10 μL微量注射器一次性注入2 μL 凝聚态的 Aβ25～35 （1 mg的 Aβ25～35 用无菌生理盐水溶解，-20℃保存，实验前将Aβ25～35溶液在37℃保温箱中放置7 d以形成聚集态的Aβ25～35），5 min内注完，留针3 min以保证溶液充分弥散后缓慢撤针。用牙托粉填补针孔，缝合皮肤并消毒。正常对照组在海马内注射同等剂量的生理盐水。单笼饲养至大鼠完全清醒。中药防治组在造模前15 d开始至成模后4周每日以9.9 g/kg的生药量灌胃，每日1次。正常对照组和AD模型组在造模后给予等量的生理盐水灌胃。造模成功4周后，大鼠用2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经左心室插管快速灌注生理盐水，同时剪开右心耳，待肝脏变白后，改灌4%多聚甲醛固定液 （用pH7.2～7.4的PBS配制）500 mL至大鼠尾巴变硬为灌注成功，开颅取脑，入相同固定液（4℃）后固定24 h。然后经乙醇梯度脱水，透明，石蜡包埋，选取含额叶皮质的脑块制作冠状连续切片。

1.4 标本采集与检测 每组动物各取7只，每只在相应的额叶部位连续切片，隔五取一，共取15张切片，按照包新民图谱的B-0.4至B-1.6平面中的Prcl区和Prcm区，在装有目镜网格400倍视野下进行阳性细胞计数，计算出0.01 mm2单位面积内的NT-3阳性神经元数目作为NT-3阳性细胞密度。选取各组同一平面含额叶皮质的切片，将切片脱蜡水化（二甲苯3 min×2次，100%酒精 3 min，95%酒精 3 min，80%酒精 3 min，70%酒精3 min，蒸馏水5 min），室温下将切片放入现配0.3%双氧水溶液中，室温孵化7 min灭活内源性酶，放入 Phosphate Buffered Saline（PBS）缓冲液（pH7.2～7.6）洗涤2 min×3次，再进行隔水热抗原修复，然后按照SP试剂盒说明书进行染色（NT-3一抗浓度：1∶50）， 最后脱水至透明 （70%酒精 3 min，80%酒精 3 min，90%酒精 3 min，95%酒精 3 min，100%酒精 5 min×2次，二甲苯3 min×2次，中性树胶封片。阴性对照组用Phosphate Buffered Saline（PBS）缓冲液液代替一抗。

1.5 统计学处理 应用SPSS16.0软件统计分析，所得数据以（）表示。统计各组染色的阳性神经细胞密度，采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 观察各组大鼠在术前行为均正常，反应灵敏，正常进食。术后3～6 d后，正常对照组恢复正常，中药组和AD模型组出现相应的反应迟钝，精神萎靡，喜静少动，少食少饮。术后10 d左右，模型组大鼠反应仍旧迟钝，觅食减少，中药组较模型组而言，精神症状较好，觅食增加。

2.2 各组大鼠额叶皮质NT-3免疫组化结果 见图1。AD模型组大鼠Prcl和Prcm区中的额叶皮质NT-3神经元数量少（与正常组比较P<0.01），染色浅；正常对照组的Prcl和Prcm区中的额叶皮质NT-3神经元数量多，染色深，轮廓清楚；中药治疗组大鼠与正常对照组接近。目镜网格法测的的各组大鼠额叶皮质阳性细胞密度见表1。

表1 各组大鼠额叶皮质阳性细胞密度比较（细胞数/0.01 mm2，）

表1 各组大鼠额叶皮质阳性细胞密度比较（细胞数/0.01 mm2，）

与正常对照组比较，*P＜0.01。

图1 免疫组化结果（×400）

3 讨 论

AD患者常有认知功能障碍，主要表现为学习、记忆能力下降。额叶皮质神经元与各叶皮质均有往返联系，额叶神经元通过抑制无关信息、选择性注意和语词输出等机制介入知觉型联想启动和知觉启动，从而参与学习记忆过程［3］。NT-3是一组与神经结构和功能密切相关的蛋白，其营养信息的传递是通过具有高亲和力活性的酪氨酸激酶受体来启动的，调控着神经元的发育、生长、分化和生存，对维持神经系统的正常功能承担着重要作用［4-5］。本研究结果显示，NT-3阳性细胞在额叶皮质各层内弥散分布，与正常对照组比较，AD模型组大鼠大脑皮质NT-3阳性神经元数量明显减少，染色变浅，表明AD大鼠的额叶皮质表达NT-3的神经元发生了退行性变。

《金匮》肾气丸载于东汉医家张仲景所著的《金匮要略》，分别主治虚劳、消渴、脚气、痰饮、转胞5个病证，乃公认的补肾名方。老年人的生理特点和病理基础多是肾气虚损，肾精亏虚，不能生髓充脑，脑失滋养，渐成痴呆，故补肾法是治疗老年性痴呆的重要方法。本实验结果显示，老年性痴呆模型组大鼠额叶皮质NT-3阳性神经细胞表达减少，阳性细胞密度比正常对照组降低，《金匮》肾气丸治疗组阳性细胞密度与正常对照组接近。因此，笔者推测以额叶皮质Prcl区和Prcm区为代表的老年性痴呆大鼠模型较正常大鼠额叶皮质存在较少的NT-3阳性细胞，《金匮》肾气丸能够通过抑制NT-3的阳性细胞的凋亡，起到延缓神经元衰老死亡的作用，从而对老年性痴呆能起到一定的防治作用。增加的NT-3又能降低细胞内活性氧的水平或改变活性氧组份比例起到保护细胞的作用，并通过影响细胞内多种蛋白酶、激酶及其复杂的信号传递系统来抑制细胞凋亡的过程［6］。

综上所述，《金匮》肾气丸对老年性痴呆大鼠大脑额叶皮质神经元的退变具有一定的防治作用。

［1］陈功香，张莉.老年痴呆患者元记忆研究的大脑机制［J］.中国特殊教育，2009，12（114）：42-50.

［2］来东兵，黄秉仁.神经营养素-3（NT-3）的结构与功能［J］.医学研究通讯，1999，28（3）：27-29.

［3］Gabrieli JDE，Poldrack RA，Desmond JE.Therole of left prefrontal cortex in language and memory［J］.Proceedings of National Academy of Sience in USA，1998，95：906-913.

［4］Qun LX，Pirvola U，Saarma M，et al.Neurotrophic factors in the auditory periphery［J］.Ann NY Acad Sci，1999，884（2）：292-304.

［5］Hossain WA，Brumwell CL，Morest DK.Sequential interactions of fibroblast growth factor-2，brain-derived neurotrophic factor， neurotrophin-3，and their receptors define criticalperiods in the development of cochlear ganglion cells［J］.Exp Neurol，2002，175（1）：138-151.

［6］郭雨霁，李盛芳.神经营养因子家族及其受体的研究进展［J］.神经解剖学杂志，2001，17（3）：288-294.