EZH2与乳腺癌分子亚型的关系及对临床病理的意义

刘 佳，王鸿雁，邓 元，曹培龙，李晓锋

(西安交通大学医学院第一附属医院病理科，陕西西安 710061)

乳腺癌是一种分子水平高度异质性的肿瘤，即使是同种组织学类型、同种临床分期的乳腺癌患者，他们的预后及治疗敏感性也不完全相同，因此，人们逐步将目光转向分子诊断技术。2000年，Perou等［1］采用 cDNA 微芯片技术，根据雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)的表达差异，将乳腺癌分为腔型(luminal subtype)、HER-2(+)型(HER-2-over-expression subtype)、基底细胞样型(basallike subtype，BLs)及正常乳腺样型(normal breast-like subtype，NBLs)。乳腺癌各分子亚型具有不同的临床病理特征，并与不同的临床结局相关，Basal-Like型由于缺乏特异性预后标记物近年来成为人们研究的焦点。

EZH2(enhancer of zeste homolog2，EZH2)是1996年发现的一种新基因，研究发现EZH2可明显抑制肿瘤转移抑制基因而促进细胞增殖扩散，促进细胞周期演进和恶性变，与肿瘤的发生发展和转移有密切的关系［2-3］。

作者在研究乳腺癌各分子亚型不同预后的基础上，采用免疫组化方法检测EZH2的表达，探讨EZH2与乳腺癌分子亚型及临床病理参数的关系，为EZH2成为乳腺癌分子亚型特异性标记物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床材料 收集西安交通大学医学院第一附属医院2000年1月-2005年12月间改良根治切除的浸润性乳腺癌80例，所有病例具有完整的临床资料并具备ER、PR、HER-2结果(除去HER-2不确定病例)，患者电话随访截至2011年1月，随访时间61～132个月，平均67.46个月。80例患者均为女性，年龄30～80岁，中位年龄50岁;绝经前43例，绝经后37例;26例患者有同侧腋窝淋巴结转移;非特异性浸润性导管癌58例，浸润性小叶癌9例，髓样癌7例，粘液癌6例;58例非特异性浸润性导管癌Ⅰ级3例，Ⅱ级19例，Ⅲ级36例。术后临床Ⅰ期28例，Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期14例。患者术前均未接受放化疗。11例患者因为乳腺癌或治疗相关因素死亡。

1.1.2 抗体和试剂 兔抗人ER单克隆抗体(RMA-0501)，兔抗人 PR单克隆抗体(RMA-0502)，兔抗人 HER-2单克隆抗体(RMA-0555)，均购自福州迈新生物技术有限公司;鼠抗人CK5/6单克隆抗体(ZM-0313)，鼠抗人CK14单克隆抗体(ZM-0311)，兔抗人EGFR单克隆抗体(ZA-0505)，兔抗人EZH2多克隆抗体(ZA-0133)，PV-6000-G通用型二步法检测试剂盒18ml，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二甲苯，梯度乙醇，甲醇30%H2O2溶液均为天津科密欧试剂有限公司产品;DAB(3，3-二氨基联苯胺)购自福州迈新生物公司;二甲基亚砜购自天津化学试剂一厂。

1.1.3 仪器和器材 RM2315旋转式组织切片机(德国Leica公司)，YT-7F生物组织摊烤片机(中国湖北)，苏泊尔电磁炉，隔水式电热恒温培养箱，Eppendorf 5418小型高速离心机(德国Eppendorf公司)，BX40显微镜成像系统(日本 OLYMPUS 公司)，微量进样器(1μL、5μL，上海安宁微量进样器厂);Eppendorf离心管，玻璃烧杯，量筒，滤纸片，切片孵育湿盒，封口膜，吸管，盖玻片，中性树胶。

1.2 免疫组化Max Vision快捷方法 蜡块切片，切片厚度2～4 μm，置入60℃恒温孵育箱过夜;切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后，3%甲醇双氧水阻断内源性过氧化物酶10 min;蒸馏水洗3次，3 min/次;PBS缓冲液冲洗3次，3 min/次;各免疫指标按照抗体说明书，选用抗原修复方法(CK14及EZH2用柠檬酸抗原热修复、CK5/6采取EDTA抗原热修复、EGFR采用胰酶消化);PBS冲洗切片3次，3 min/次;滴加一抗80μL/张，30℃孵育3 h;PBS缓冲液冲洗切片3次，3 min/次;滴加二抗80μL/张，室温下或37℃孵育30 min;PBS洗切片3次，3 min/次;DAB显色1～2 min，显微镜下控制显色效果，自来水冲洗;苏木素复染2～5 min，自来水冲洗;梯度乙醇脱水、二甲苯透明后树胶封片。用已知阳性组织作阳性对照片，同型阴性对照作阴性对照片。

1.3 免疫组化结果判读标准

1.3.1 免疫组化阳性结果定位 ER、PR、EZH2阳性表达定位于细胞核，细胞核呈棕黄色着色;HER-2阳性表达定位于细胞膜，细胞膜呈黄色或棕黄色着色;CK5/6、CK14阳性表达定位于细胞质，细胞质呈棕黄色着色;EGFR阳性表达定位于细胞质或细胞膜，细胞质或细胞膜呈棕黄色着色。

1.3.2 阳性判读标准 (1)ER、PR染色强度:0分为阴性，1分为弱阳性，2分为中等阳性，3分为强阳性;阳性细胞百分比计分:＜1%计为1分，1% ～10%为2分，11% ～33%为3分，34% ～66%计为4分，≥67%计为5分。染色强度和阳性细胞百分比所计分数两项相加≥3者为 ER/PR阳性［4］。(2)阳性细胞数 ＞10%视为 CK5/6、CK14、EGFR 阳性［5］。(3)阳性细胞数＞30%视为EZH2阳性表达［6］。(4)按照乳腺癌 HER-2 检测指南(2009 版)［7］，HER-2(3+)为阳性表达:＞30%的浸润癌细胞呈现强、完整的细胞膜棕褐着色;不确定表达:即HER-2(2+)，为至少10%的肿瘤细胞有完整的细胞膜着色，着色不均匀或强度弱;HER-2(-)或HER-2(1+)为HER-2阴性:癌细胞不着色或任何比例的浸润性癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色。

1.4 乳腺癌分子亚型划分方法 Luminal型乳腺癌:ER(+)/PR(+)、HER-2(-);HER-2(+)型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(3+);Basal-like型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(-)、CK5/6(+)/CK14(+)/EGFR(+);Normal breast-like型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(-)、CK5/6(-)、CK14(-)、EGFR(-)［8-9］。

1.5 统计学处理 结果采用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计。组间比较采用χ2检验和非参数秩和检验;生存分析采用 Kaplan-Meier法，生存曲线间用Log-rank检验比较;P＜0.05为显著差异。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 图1所示为ER、PR、HER-2、CK5/6、CK14、EGFR、EZH2 阳性表达图，阳性表达率分别为 48.74%(39/80)、55.00%(44/80)、18.75%(15/80)、15.00%(12/80)、11.25%(9/80)、72.50%(58/80)、45.00%(36/80)。

2.2 分子亚型的构成 在80例乳腺癌研究对象中，Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型和Normal breast-like型乳腺癌分别占61.25%(49 例)、10.00%(8 例)、25.00%(20 例)、3.75%(3例)。由于Normal breast-like型乳腺癌例数过少，因此暂不予统计。

2.3 分子亚型与临床病理特征的关系 数据经统计学分析得到，乳腺癌分子亚型与患者的年龄、肿瘤大小、同侧腋窝淋巴结转移、组织学类型、组织学分级、术后临床分期均无相关性(P ＞0.05)，与绝经与否有关(P=0.036 ＜0.05)。77例乳腺癌患者，10例死于乳腺癌或者治疗相关因素，病死率为12.99%，死亡病例分别为 Luminal型3例、HER-2(+)型1例、Basal-like型乳腺癌6例，各分子亚型组病死率的差异有统计学意义(χ2=7.168，P=0.028 ＜0.05)。

2.4 乳腺癌分子亚型预后分析 在上述结果的基础上，进一步进行Kaplan-Meier生存分析显示:Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌患者平均生存时间(月)分别为119、89、69，三组分子亚型总生存率差异整体水平间比较具有统计学意义(Log-rank=7.175，P=0.028 ＜0.05);经两两比较发现 Luminal型与Basal-like型乳腺癌患者总生存率间差异有统计学 意 义 (Log-rank=7.324，P=0.007 ＜0.016)，HER-2(+)型与 Basal-like型乳腺癌患者总生存率间差异无统计学意义(Log-rank=0.668，P=0.414 ＞0.016)(图 2)。

2.5 EZH2与临床病理特征的关系 由表1中数据可见，EZH2阳性表达与患者的年龄、绝经与否、肿瘤大小、肿瘤的组织学类型均不相关(P＞0.05)，与同侧腋窝淋巴结转移与否、肿瘤组织学分级和术后临床分期相关(P＜0.05)。同侧腋窝淋巴结转移组共25例，其中EZH2阳性表达22例(阳性表达率88.00%)高于同侧腋窝淋巴结无转移组(P=0.001);截至随访终止时间，共有10例患者死亡，其中7例EZH2阳性表达，EZH2阳性表达组病死率20.00%(7/35)，患者中位生存时间为47个月;3例患者EZH2阴性，EZH2阴性组病死率7.14%(3/42)，患者中位生存时间为49个月;两组病死率的差异无统计学意义(P=0.095 ＞0.05)。

图2 77例浸润性乳腺癌患者各分子亚型的总生存率Fig.2 Overall survival rates of molecular subtypes in 77 cases with invasive breast cancers

表1 EZH2与临床病理特征之间的关系Table 1 Relationship between EZH2 and clinicpathologic parameters (%，n=77)

2.6 EZH2与乳腺癌预后的关系 Kaplan-Meier生存分析显示:EZH2的表达状态与乳腺癌患者总生存率无相关性(Log-rank=2.788，P=0.095)。

2.7 EZH2在乳腺癌分子亚型中的表达 77例乳腺癌研究病例中，EZH2阳性表达率为45.45%(35/77)。Luminal型组 EZH2阳性表达 率 为 34.60%(17/49)，HER-2(+)型50.00%(4/8);Basal-like 型 70.00%(14/20)，高于EZH2在Luminal型和HER-2(+)型两组中的阳性表达率。三组乳腺癌EZH2阳性表达率的差异经统计学检验具有统计学意义(χ2=7.215，P=0.027 ＜0.05)。见表2。

表2 EZH2在乳腺癌分子亚型中的表达Table 2 The expressions of EZH2 in molecular subtypes of breast carcinoma (%，n=77)

表2数据可见，EZH2在HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌中阳性表达率高于Luminal型乳腺癌，前两者乳腺癌均为ER和PR阴性的乳腺癌，我们经Spearman双变量相关性分析得到:EZH2与ER、PR之间均呈负相关关系(r=-0.260，P=0.020 ＜ 0.05;r=-0.242，P=0.030 ＜0.05)。

3 讨论

自乳腺癌分子亚型的概念提出后，人们采用免疫组织化学方法展开对各分子亚型乳腺癌临床病理特征和治疗反应性的研究。国内外已有相关研究报道，然而结果并不完全统一。

Wiechmann 等［8］报道:Luminal型乳腺癌在分子亚型中所占比例最高且预后较好;HER-2(+)型占6%，预后不良;Basal-like型乳腺癌约占15%，总生存率最低。与Luminal型乳腺癌相比，HER-2(+)型乳腺癌更容易表现出同侧腋窝淋巴结受累、血管淋巴管侵犯、局部复发率高的特点;各亚型与患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结受累、血管淋巴管侵犯、细胞核分级等参数均具有相关性。而另一则报道显示，HER-2(+)型乳腺癌复发风险 39.4%、病死率33.3%，均高于其他类型乳腺癌，因此 HER-2(+)乳腺癌预后最差［10］;三种分子亚型组织学分级的差异具有统计学意义。本实验发现，Basal-like型乳腺癌患者病死率30%，预后最差，这与Wiechmann等的报道是一致的;但乳腺癌分子亚型和患者绝经与否外的其他临床病理参数均无相关性，这与上述文献不符，我们考虑这与实验方法和环境、免疫组化判读标准不同、研究对象种族差异等因素有关。尽管乳腺癌分子亚型对患者预后判断的优势得到证实，但肿瘤形态学仍然适应于临床治疗和预后风险预测的需要，此实验还尝试将乳腺癌分子亚型与传统病理组织学形态相结合，以期发现两者之间的内在联系。实验结果并没有发现乳腺癌组织学类型与分子亚型的相关性。Sek等［11］选用乳腺Paget's病患者为研究对象进行分子亚型的分析，得出HER-2(+)型是乳腺Paget's病的优势亚型，占86%(37/43)，Luminal A型、Luminal B型分别占2%和12%，没有表现为Basal-like型的患者。这又对分子亚型的组织学构成做了补充。

EZH2是一种基因抑制复合物，属于PcG多梳基因家族，主要通过减少转录因子与DNA结合，抑制靶基因在染色体结构中的表达，EZH2不仅通过使肿瘤转移抑制基因功能失活，亦可通过抑制肿瘤细胞凋亡而发挥作用［12］。目前已知EZH2在前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均有高水平表达。Raaphorst［13］等用正常乳腺组织、癌前病变组织、浸润性乳腺癌研究EZH2在三者中的表达，结果显示正常乳腺组织不表达EZH2，而在乳腺癌特别是低分化乳腺癌中表达水平明显高于癌前病变组织。同样的，Wang［6］等用结肠癌及癌旁组织研究得到EZH2阳性表达率在不同临床分期差异有显著的统计学意义(P=0.001)，EZH2为结肠癌患者的不良预后指标。Reijm等［14］对EZH2阳性表达乳腺癌采用三苯氧胺治疗后，其临床缓解率低于EZH2阴性者，患者生存期短，因此三苯氧胺治疗的乳腺癌患者若EZH2阳性表达常预示预后不良。然而，患者在临床治疗中，往往内分泌治疗的同时采用联合化疗的方法，因此，验证该实验结果尚存在困难。

EZH2与乳腺癌分子亚型关系的研究报道尚少，Gonzalez等［15］在研究 EZH2 与 BRCA1 的关系时报道，EZH2在ER阴性乳腺癌中显著高表达，强调了EZH2对于该型乳腺癌生长和预后的重要意义。同时又有文献进一步报道，EZH2是ER阴性乳腺癌的较特异性标记物之一［16］。因此，EZH2有望成为基底细胞样型乳腺癌诊断或预后的因子。

本课题乳腺癌中EZH2阳性表达率在同侧腋窝淋巴结转移、组织学分级、术后临床分期中的差异具有统计学意义(P＜0.05)，与患者年龄、绝经与否、肿瘤大小和组织学类型无关(P＞0.05);EZH2在同侧腋窝淋巴结转移、组织学分级和术后临床分期高的患者中阳性表达率，高于无淋巴结转移、组织学分级及临床分期低者。但是，EZH2阳性表达组和阴性组患者的死亡率和总生存率之间的差异不具有统计学意义(P＞0.05)，提示EZH2的表达状态尚不是影响乳腺癌患者总生存率的因素。我们对EZH2与乳腺癌分子亚型关系的分析发现，EZH2在 Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌中阳性表达率分别为 35.00%、50.00%、70.00%，各分子亚型之间 EZH2 阳性表达率的差异具有统计学意义(P=0.027＜0.05)，这表明 Basal-like型乳腺癌 EZH2的阳性表达率高于其他两组，提示EZH2或许可作为Basal-like型乳腺癌的标记物之一。EZH2与 ER、PR 呈负相关(r=-0.260，P=0.020;r=-0.242，P=0.030)，ER、PR 阳性表达水平越高，EZH2阳性表达率反而越低。这与Reijm［14］等所得 EZH2与ER关系的结论(r=-0.330，P ＜0.001)是一致的，提示 EZH2 可作为激素受体阴性乳腺癌特别是Basal-like型乳腺癌的分子标记物之一。由于Basal-like型乳腺癌同免疫组化建立的三阴性乳腺癌具有相似的免疫表型和临床特征，ER、PR阴性同时绝大部分伴有BRCA1缺失或突变，EZH2通过调节BRCA1蛋白表达和BRCA1磷酸化水平促进细胞增殖并使细胞向G2/M期转化，当BRCA1水平下降时，它逆向上调 EZH2［14-15］，因此 Basallike型乳腺癌常有EZH2高表达，预后很差。这为EZH2阳性表达患者预后不良和EZH2成为Basal-like型乳腺癌特异性标记物的观点提供了理论支持。

综上所述，我们发现EZH2阳性表达多存在于组织学分级高、临床分期晚及同侧腋窝淋巴结转移的患者，因此EZH2阳性表达患者往往预后不良。尽管EZH2不同表达状态时患者总生存率的差异没有统计学意义，但具有不同预后的各分子亚型间EZH2的阳性表达率却有显著趋势，即EZH2在预后较差的Basal-like型乳腺癌中高表达，并且EZH2与淋巴结转移、组织学分级、术后临床分期等预后相关指标存在密切正相关关系，因此，我们认为EZH2具有评价乳腺癌患者预后的价值。适当增加样本量，或许可以得到预期结果。乳腺癌的预后不是单一因素作用的结果，将分子亚型与传统的临床病理参数相结合，综合评价才能获得更好的效果。

［1］PEROU，CHARLES M，SERLIE，et al.Molecular Portraits of human breast tumors ［J］.Nature，2000，406:747-747.

［2］VARAMBALLY S，DHANSEKARAN S M，ZHOU M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer［J］.Nature，2002，419(6907):624-629.

［3］SATIJN D P，OTTE A P.Polycomb group protein complexes:do different complexes regulate distinct target genes［J］?Biochim Biophys Acta，1999，1447:1.

［4］HARVEY J M，CLARK G M，OSBORNE C K，et al.Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to adjuvant endocrine therapy in breast cancer［J］.J Clin Oncol，1999，17(5):1474-1481.

［5］DELGALLO W D，RODRIGUES JRP，BUENO S P，et al.Cell blocks allow reliable evaluation of expression of basal(ck5/6)and luminal(ck8/18)cytokeratins and smooth muscle actin(SMA)in breast carcinoma ［J］.Cytopathology，2010，21:259-266.

［6］WANG C G，YE Y J，YUAN JING，et al.EZH2 and STAT6 expression profiles are correlated with colorectal cancer stage and prognosis［J］.World J Gastroenterol，2010，16(19):2421-2427.

［7］The Writing Group of guidelines for HER2 detection in breast cancer，the 2009 version(乳腺癌 HER2检测指南:2009版编写组).Guidelines for HER2 detection in breast cancer，the 2009 version ［J］.CHINESE JOURNAL OF PATHOLOGY(中华病理学杂志)，2009，38(12):836-840.

［8］WIECHMANN L，SAMPSON M，STEMPEL M，et al.Presenting features of breast cancer differ by molecular subtype ［J］.Ann Surg Oncol，2009(16):2705-2710.

［9］KIM M J，RO J Y，AHN S H.Clinicopathologic significance of the basal-like subtype of breast cancer:a comparison with hormone receptor and Her2/neu-overexpressing phenotypes［J］.Human Pathology，2006，37:1217-1226.

［10］MUNOZ M，ACENERO J F，MARTIN S，et al.Prognostic significance of molecular classification of breast invasive ductal carcinoma ［J］.Arch Gynecol Obstet，2009，280:43-48.

［11］SEK P，ZAWROCKI A，BIERNAT W，et al.HER-2 molecular subtype is a dominant subtype of mammary Paget，s cells.An immunohistochemical study［J］.Histopathology，2010，57:564-571.

［12］WAGERBER N，HOLLAND D，BULKESCHER J，et al.The enhancer of zeste homolog 2 gene contributes to cell proloferation and apoptosis resistance in renal cell carcinoma cells［J］.Int J Cancer，2008，123:1545-1550.

［13］RAAPHORST F M，MEIJER C J，FIERET E，et al.Poorly differentiated breast carcinoma is associated with increased expression of the human polycomb group EZH2 gene ［J］.Neoplasia，2003，5(6):481-488.

［14］REIJM E A，JANSEN M，RITSTIER K R.Decreased expression of EZH2 is associated with upregulation of ER and favorable outcome to tamoxifen in adnanced breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，125:387-394.

［15］GONZALEZ M E，LI X，TOY K，et al.Downregulation of EZH2 decreases growth of estrogen receptor-negative invasive breast carcinoma and requires BRCA1 ［J］.Oncogene，2009，28:843-853.

［16］CELINA G，KLEER M D.Carcinoma of the breast with medullary-like features diagnostic challenges and relationship with BRCA1 and EZH2 functions［J］.Arch Pathol Lab Med，2009，133:1822-1825.