三尖杉酯碱通过下调Mcl-1蛋白诱导NB4细胞凋亡

邬春晓，沈红强，夏大静

(1.浙江大学医学院附属妇产科医院检验科，浙江杭州 310006;2.浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心，浙江杭州 310003;3.浙江大学医学院免疫学研究所，浙江杭州 310058)

Mcl-1是Bcl-2家族多结构域抗凋亡蛋白，Mcl-1的过表达可以促进恶性肿瘤细胞的生存，Mcl-1的表达升高常见于急性髓细胞白血病(AML)，在细胞的生长和分化过程中发挥重要作用［1-3］。Mcl-1的半衰期较短，在细胞凋亡过程中受细胞内信号途径调控迅速下调。Mcl-1蛋白表达下调可促进肿瘤细胞的凋亡［4-5］。

三尖杉酯碱(HT)、高三尖杉酯碱(HHT)、异三尖杉酯碱(IHT)、脱氧三尖杉酯碱(DHT)是从我国特有植物海南粗榧中分离出来的具有抗肿瘤活性的生物碱，其中HT和HHT抗肿瘤作用最强，我国在世界上首先将其用于急性髓细胞白血病的临床治疗，并获得显著疗效［6-7］。研究表明，HT能通过多种途径抑制蛋白合成和克隆形成，诱导白血病细胞凋亡［8-9］。然而，HT对急性早幼粒细胞白血病(APL)的作用及其机制的研究目前报道较少。本研究考察了HT对APL细胞株NB4细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用，推测HT可能通过下调Mcl-1蛋白发挥诱导NB4细胞凋亡的抗白血病作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人急性早幼粒白血病细胞株NB4购于ATCC。APL样本细胞由浙江大学医学院附属第二医院提供。RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司;台盼兰染料，PI，AO，EB购于美国 Sigma公司，Western-blot抗体:对照 β-Actin购自美国Santa Cruz公司，PARP、Bax、Bak、Bcl-2 和 Mcl-1单克隆抗体均购自美国Cell-Signaling公司;化学增强发光试剂盒购于英国Amersham Biosciences公司;Lipofectamine细胞转染试剂盒购于美国Gibco公司。

1.2 细胞培养 人类急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞均培养于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%(v/v)经加热灭活的胎牛血清的R/MINI-1640培养液中。所有实验用细胞均于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3 外周血淋巴细胞的提取 经患者同意后，抽取5 ml新确诊未进食的APL患者血液。外周血淋巴细胞的提取采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心进行分离。将5 mL血液与5 ml PBS混合，轻柔吹吸。后将稀释后的血液加到单核细胞分离液的液面上。3000 r/min离心10 min，将分离液从离心机中取出，吸取中间的淋巴细胞层。将分离的淋巴细胞养于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mmol/L 谷氨酰胺及20%(v/v)经加热灭活的胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于 37°C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，加药，于48 h后收集细胞。

1.4 生长抑制和细胞毒作用检测 药物对白血病细胞的生长抑制作用采用细胞计数法考察。取对数生长期细胞(2×105/m)接种于24孔板，2 ml/孔。加入不同浓度药物孵育72 h后于显微镜下计数，依照如下公式计算细胞生长抑制率(GI)，(GI50:使细胞生长抑制率达50%时的药物浓度)。IG=(对照孔细胞数-加药孔细胞数)/对照孔细胞数×100%。药物的细胞毒作用通过台盼蓝排斥实验检测。各孔活细胞数与该孔总细胞数的比值即为该浓度条件下的细胞存活率。

1.5 AO-EB双染法凋亡形态观察 利用丫啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)双染法考察凋亡细胞的形态学变化。取对数生长期细胞，以每孔2×105/mL的细胞密度接种于24孔板中，每孔2 ml。药物作用后，取1 mL细胞悬液，离心，弃去上清液，重悬于30μL PBS中，然后加入AO/EB 等体积混合液 5μL(100 μg/ml AO，100 μg/mL EB)，混匀。取10μL混合液点于洁净载玻片上，用盖玻片封片，在荧光显微镜490 nm波长下记录并观察细胞的染色情况和形态学改变。细胞呈现AO着色的绿色荧光同时EB拒染，并出现核皱缩、边缘化、发芽、发泡以及凋亡小体等典型凋亡形态的细胞被认为是早期凋亡细胞。细胞若呈现EB着色的红色荧光，说明细胞已经死亡，为坏死细胞或晚期凋亡细胞。

1.6 PI染色流式细胞术凋亡检测 经HT处理相应时间后离心收集细胞(2×106个)，PBS洗涤后用200μL PBS重悬，加入10 ml预冷的75%乙醇中固定过夜后收集样品。离心收集细胞，于500 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育30 min后，加入PI染色液，使其终浓度为60 μg/ml。样品DNA含量采用流式细胞仪(Becton Dickinson)检测，染料激发波长为488 nm，吸收波长为625 nm。纵坐标表示细胞数，横坐标表示荧光强度即DNA含量。流式细胞仪每个样品共收集10 000个细胞。相应数据采用CELLQuest软件(Becton Dickinson)进行分析处理。

1.7 Western Blot检测 凋亡相关蛋白细胞总蛋白(100 μg)通过 RIPA裂解缓冲液［50 mmol/L Tris盐酸，150 mmol/L 氯化钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，1%NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，1 mmol/L PMSF，100 μmol/L leupeptin 和2 μg/mL aprotinin，pH 8.0］裂解得到。应用Bradford法定量蛋白，通过SDS-PAGE将蛋白进行分离，应用Bio-Rad电转仪将蛋白湿转到硝酸纤维素膜上。用0.2%的丽春红染色液预染。用5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜2 h后，加入10 mL稀释浓度的待测蛋白特异性抗体，于4oC结合过夜。TBST洗涤后与标记的二抗室温结合2 h后TBST洗涤，硝酸纤维素膜经化学发光试剂(ECL kit，Amersham Biosciences)处理后，与胶片于曝光板中压片，经显影液、定影液处理后扫描曝光片。

1.8 RNA干扰实验 将siRNA电转化法转染目的细胞，Mcl-1 siRNA(sc-35877)购于Santa Cruz Biotechology，Inc CA，方法见 Amaxa 电转化手册。收集1×106个对数生长期细胞，重悬 于 100 μL nucleofector solution(Amaxa Reagent V)，加入 100 pmol siRNA，运行 Amaxa T-016电转化程序。电转化细胞转移到12孔板中，加入4 mL新鲜培养液37oC复苏12 h，加入药物处理，进行蛋白电泳免疫印记实验。

1.9 统计学处理 统计学处理采用SPSS 13.0 for Windows统计处理软件分析。计量资料以均数±标准差表示。多组均数间比较采用One-way ANOVA，有显著差异时，再作两两比较的q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HT对NB4细胞的生长抑制作用和细胞毒性作用 通过细胞计数法可对HT对APL细胞系NB4细胞的生长抑制作用和细胞毒作用进行考察。HT在40 nmol/L的浓度下就能强烈的抑制 NB4 细胞的生长，GI50为(32.0 ±2.5)nmol/L，HT处理NB4细胞72 h，HT呈现剂量依赖性的抑制NB4细胞的生长(图1)。NB4细胞经HT 60 nmol/L处理72 h，细胞存活率均下降到20%以下(图2)，并且在80 nmol/L HT的作用下细胞存活率快速下降。

图1 HT对NB4细胞的生长抑制作用Fig.1 Growth inhibition of HT in NB4 cells

图2 HT对NB4细胞的细胞毒作用Fig.2 Cytotoxicity of HT in NB4 cells

2.2 HT对NB4细胞的凋亡诱导作用 通过AO-EB染色的荧光显微观察和PI染色的流式细胞术考察了HT对NB4细胞的凋亡诱导作用。100 nmol/L HT处理NB4细胞3 h、6 h、12 h，可显著诱导NB4细胞凋亡，并且呈现良好的时间依赖关系，并可观察到典型的细胞凋亡形态(图3)。分别用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L HT处理6 h，也可显著诱导NB4细胞凋亡，并呈现良好的剂量依赖关系，采用PI染色的流式细胞术可以检测到显著的SubG1凋亡峰，100 nmol/L HT处理NB4细胞6 h，约66%的NB4细胞发生凋亡(图4)。

2.3 HT对NB4细胞凋亡相关蛋白的影响 HT可以引起HL-60细胞线粒体膜电位下降并导致caspase-9和 caspse-3 的活化［8］，而线粒体膜电位的下降主要由Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白所调控［3］。因此应用Western Blot考察了HT处理 NB4 细胞后 Bax、Bak、Bcl-2 和Mcl-1的蛋白水平，PARP的活化情况。HT在100 nmol/L和200 nmol/L的浓度下处理NB4细胞6 h，并不活化和上调促凋亡蛋白Bax和Bak，也不改变抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平，但可迅速显著下调凋亡抑制蛋白Mcl-1，同时引起凋亡标志性蛋白PARP的裂解活化(图5)。结果提示，HT诱导NB4细胞凋亡可能与凋亡抑制蛋白Mcl-1下调相关。

图5 HT对凋亡相关蛋白的影响Fig.5 The levels of apoptosis regulating proteins after treated with HT

2.4 siRNA沉默 Mcl-1对 HT诱导NB4细胞凋亡作用的影响 利用RNA干扰技术，应用Mcl-1 siRNA沉默NB4细胞Mcl-1的表达。NB4细胞预处理Mcl-1 siRNA后，Mcl-1蛋白表达被抑制，与空白载体对照相比，40 nmol/L HT处理细胞6 h，可以显著地诱导NB4细胞凋亡并引起PARP的裂解(P＜0.05)(图6)，结果提示，沉默Mcl-1可以显著的提高HT对NB4细胞的凋亡作用。

图6 siRNA沉默Mcl-1 HT诱导NB4细胞凋亡结果Fig.6 The influence of Mcl-1 siRNA on HT induced apoptosis in NB4 cells

2.5 HT对原代APL细胞凋亡诱导作用 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心，提取APL患者的原代白血病细胞。HT处理样本细胞6h，100 nmol/L HT分别诱导51.2%APL-1样本细胞和 55.9%APL-2样本细胞凋亡(图 7)。Western Blot结果显示，100 nmol/L HT处理样本细胞6h，均可显著下调APL-1和APL-2样本细胞Mcl-1蛋白水平(图8)。

图7 HT诱导急性早幼粒白血病样本细胞凋亡结果Fig.7 Apoptotic induction of HT in APL samples

图8 HT下调急性早幼粒白血病样本细胞Mcl-1蛋白Fig.8 HT down regulated levels of Mcl-1 in APL sample cells

3 讨论

过去，我国率先将HT用于急性髓细胞白血病的临床治疗，其抗肿瘤作用主要为抑制肿瘤细胞DNA和蛋白质的合成，但作用机制尚不明确［9］。本研究表明，HT对 APL细胞系 NB4细胞具有强的生长抑制作用和细胞毒性作用。本实验中HT对NB4细胞的生长抑制作用和细胞毒性作用呈现良好的时间依赖和剂量依赖关系。HT对NB4细胞所产生的细胞毒性作用可能有赖于HT引起NB4细胞快速凋亡。100 nmol/L和200 nmol/L HT作用3 h可以分别诱导41%和63%NB4细胞凋亡。报道表明，HT可通过内源性细胞凋亡通路诱导HL-60细胞凋亡，并引起caspase-9和caspase-3的活化，以及CytoC的释放［8］。为此，我们初步探讨了HT作用NB4细胞后对线粒体凋亡通路相关蛋白水平的影响。本研究表明，HT作用NB4细胞6 h后，线粒体Bcl-2家族凋亡蛋白Bax和Bak的蛋白水平没有改变，提示凋亡促进蛋白Bax和Bak的蛋白表达没有升高。Bcl-2为Bcl-2家族抗凋亡蛋白，HT并不影响Bcl-2的蛋白水平，提示Bcl-2在HT诱导的NB4细胞凋亡过程中并不发挥决定作用。HT可以显著迅速的引起NB4细胞Mcl-1的下调，并伴随着凋亡标准性蛋白PARP的裂解活化。Mcl-1为Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白，有报道表明，下调Mcl-1可以引起肿瘤细胞凋亡［3］。因此，HT诱导NB4细胞凋亡可能通过下调Mcl-1蛋白实现。我们通过细胞转染，将Mcl-1蛋白siRNA转染NB4细胞，沉默Mcl-1蛋白表达，结果显示在对照组细胞中siRNA可以显著下调Mcl-1的蛋白水平。在给予低剂量的HT时，对照空载细胞没有出现明显的细胞凋亡和PARP蛋白的裂解活化，而Mcl-1 siRNA沉默组细胞呈现显著的细胞凋亡和PARP蛋白的裂解活化。因此，Mcl-1在HT诱导NB4细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。这提示HT可能通过下调Mcl-1发挥诱导细胞凋亡的抗白血病作用。为了进一步验证我们的假设，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心的方法提取了APL患者的原代白血病细胞。HT可以显著诱导样本白血病细胞凋亡。Western Blot结果显示，HT给药后均可显著下调APL-1和APL-2样本细胞Mcl-1蛋白水平。

综上所述，HT可以显著的抑制NB4细胞的生长并对NB4细胞产生强的细胞毒性，HT对NB4细胞的细胞毒性作用可能通过诱导细胞凋亡实现。通过对NB4细胞和临床APL原代细胞的作用，提示HT可能通过下调Mcl-1蛋白发挥诱导细胞凋亡的抗APL作用。

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