Th17相关性细胞因子在新生小鼠MCMV肝炎中的表达及意义

张恩胜 王 军 万雪媛 潘兆军 曹 杨 (山东省滕州市中心人民医院新生儿科，滕州277550)

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)属β疱疹病毒亚科，具有较严格的种属特异性和潜伏-激活的特征，婴幼儿尤其是新生儿HCMV感染会引起肝功能损害、肝脾肿大、感觉神经性耳聋(Sensorineural hearing loss，SNHL)和中枢神经系统症状[1，2]。巨细胞病毒肝炎的发病机理与巨细胞病毒侵袭肝细胞后导致的免疫应答及免疫调节紊乱有关[3]，但其具体发病机制目前尚未阐明。

辅助性17细胞(Th17)是新发现的CD4+T辅助细胞亚群，能特异性地产生 IL-17效应因子[4]。研究表明，Th17细胞介导了多种自身免疫疾病的组织损伤，Ramon Arens[5]等研究发现，在鼠巨细胞病毒 (Murine cytomegalovirus，MCMV)感染的小鼠脾和肺组织中有IL-17的表达。IL-23是维持Th17细胞亚群分化和稳定的重要因子，对维持Th17细胞增殖和稳定起着重要作用[6，7]。本实验通过建立MCMV感染BALB/c新生小鼠肝炎模型，观察治疗前后小鼠外周血及肝脏中IL-17、IL-23的变化情况，进而推测MCMV感染对新生小鼠Th17亚群的影响，为MCMV肝炎的免疫致炎机制提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒培养 小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)、MCMV Smith株(引自北京空军总医院)，按常规方法培养传代。测定病毒致半数细胞感染量TCID50为104.31/0.1ml。

1.1.2 动物 SPF级BALB/c性成熟小鼠，购自南京医科大学实验动物中心。

1.1.3 药品 更昔洛韦，国药准字:H10980189，规格为50 mg/瓶，湖北科益药业有限公司生产。

1.1.4 主要试剂与仪器 日本产OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪;IL-17 ELISA试剂盒(M2300，美国 R＆D Systems公司);IL-23 ELISA 试剂盒(M1700美国R＆D Systems公司);中性甲醛;脱钙液;DNA提取试剂盒、PCR试剂盒(均购自北京天根生物工程有限公司);MCMV-PCR上游引物:5'-TCAGCCATCAACTCTGCTACCAAC-3'，下游引物:5'-ATCTGAAACAGCCGTATATCATCTTG-3'[8]， IL-17、IL-23(p19亚基)和看家基因β-肌动蛋白(β-actin)基因序列经GenBank获得，应用Primer5.0软件设计目的基因和β-actin的引物，上海生工生物技术有限公司合成引物(引物序列见表1)。

1.2 方法

1.2.1 MCMV的活化与扩增 MCMV经3T3细胞扩增活化，并采用细胞病变法滴定病毒 TCID50(104.31/0.1 ml)。

1.2.2 动物分组 SPF级BALB/c新生小鼠72只，随机分为正常对照组、病毒组、更昔洛韦治疗组，每组24只新生小鼠。对照组腹腔注射生理盐水20 μl，病毒组腹腔接种 MCMV 20 μl，治疗组于接种病毒后当日腹腔注射更昔洛韦60 mg/(kg·d)，连用2周，母乳喂养，每日观察小鼠的发育状况。

1.2.3 取材 造模后第3、7、14天小鼠摘除眼球取血。水合氯醛按0.3 ml/100 g的剂量麻醉新生小鼠，75%酒精浸泡小鼠2～3分钟，将小鼠置于生物安全柜内，同时准备好手术器械:固定小鼠四肢于泡沫板，在剑突处划开皮肤，向上下纵行剪开，切开腹膜后取肝脏，分置于冻存管内，-80℃保存备用。将肝脏置于中性甲醛中固定、脱钙、石蜡切片、HE染色、光镜观察。

1.2.4 谷丙转氨酶(ALT)检测 采集小鼠血液样本后，全自动生化分析仪检测血清ALT水平。

1.2.5 ELISA法测血清IL-17、IL-23蛋白浓度 采集小鼠血液样本并分离血浆，按照ELISA试剂盒说明检测小鼠IL-17、IL-23的表达水平，根据样品的OD值用Excel2008计算出相应IL-17、IL-23浓度。

1.2.6 PCR检测 采用蛋白酶K裂解法提取MCMV进行MCMV-PCR检测。同时用RT-PCR法进行小鼠肝脏 IL-17mRNA、IL-23mRNA检测。反应体系:DNA 模板(肝脏提取)2 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，Taq 酶 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，共 25 μl。反应条件:94℃预变性3分钟;然后执行35个循环:94℃变性30秒，各目的基因的退火温度见表1，退火30秒，72℃延伸40秒，最后72℃总延伸5分钟。电泳条件:100 mV电泳40分钟。以S1000 Thermal-Cycler PCR扩增仪进行扩增，扩增片段见表1。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，以GIS-2008型数码凝胶图像分析系统进行拍照记录。

1.3 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件包，计量数据以

表1 IL-17、IL-23、MCMV及β-actin引物序列Tab．1 Primer sequence of mouse IL-17，IL-23，MCMV and β-actin

2 结果

2.1 小鼠一般情况及肝组织病理学检查 小鼠于腹腔注射MCMV后生长发育缓慢(皮毛凌乱稀疏、缺乏光泽、睁眼延迟、活动差、体型略显消瘦)。3天后肝脏HE染色，光镜下可见肝细胞气球样变性，点灶状坏死，门管区炎性细胞浸润，肝细胞核内病毒包涵体，提示造模成功。

2.2 肝组织MCMV-DNA PCR检测结果 对照组肝脏组织MCMV-DNA PCR电泳各时间点均未见阳性条带;病毒组MCMV-DNA PCR电泳全部出现阳性条带，提示小鼠肝脏有MCMV感染;更昔洛韦治疗组与病毒组相比MCMV-DNA PCR电泳阳性条带的亮度明显减低，提示更昔洛韦对肝脏MCMV感染病毒的复制有明显的抑制作用(见图1)。

2.3 血清ALT水平 由(表2)可见，与正常对照组相比，病毒组小鼠谷丙转氨酶水平明显升高，7天时达高峰，14天时下降;与病毒组相比，更昔洛韦治疗组ALT水平在3天时即有明显下降，7天时进一步下降，14天时接近正常。

图1 MCMV感染新生小鼠不同时期肝脏中MCMV PCR电泳图Fig．1 MCMV PCR electrophoresis of different periods MCMV infection of the liver in the newborn mice

表2 三组小鼠血清ALT比较(±s)Tab．2 The comparison of the three groups of mice serum ALT(±s)

表2 三组小鼠血清ALT比较(±s)Tab．2 The comparison of the three groups of mice serum ALT(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point;3)P＜0.05，compared with the virus group in the corresponding point;4)P＞0.05，compared with the control group in the corresponding point.

Groups sALT(U/L)9.83 Virus group 59.68±11.641)175.64±58.071)162.09±16.481)Treatment group 41.62±11.323)93.87±60.272)28.97±8.762)4)3d 7d 14d Control group 25.16±10.72 24.89±8.59 27.36±

2.4 血清IL-17、IL-23水平 病毒组小鼠自感染第3天血清中IL-17、IL-23水平开始升高，并维持较高水平，直至第14天仍高于正常对照组;治疗组小鼠自治疗后3天，血清IL-17、IL-23水平开始下降，并持续下降直至治疗后第14天。治疗组各时点血清IL-17、IL-23水平仍高于正常对照组。病毒组各时点IL-17、IL-23蛋白表达量均高于正常对照组相应时点(P＜0.01);对照组各时点IL-17、IL-23蛋白表达量比较差异无显著性(P＞0.05);治疗组治疗7、14天后IL-17、IL-23蛋白表达量低于病毒组相应时点(P ＜0.01)。见表3、4。

2.5 肝脏中IL-17、IL-23mRNA水平 病毒组小鼠自感染第3天肝组织中IL-17、IL-23mRNA水平开始升高，并维持较高水平，直至第14天仍高于正常对照组;治疗组小鼠自治疗后3天，IL-17、IL-23mRNA水平开始下降，并持续下降直至治疗后第14天。治疗组各时点IL-17、IL-23mRNA水平仍高于正常对照组。病毒组各时点IL-17、IL-23mRNA表达量均高于正常对照组相应时点(P＜0.01);对照组各时点IL-17、IL-23mRNA表达量比较差异无显著性(P＞0.05);治疗组治疗 7天、14天后 IL-17、IL-23mRNA表达量低于病毒组相应时点(P＜0.01)。见表5、6，图2 ～5。

表3 三组小鼠血清IL-17比较(±s)Tab．3 The comparison of the three groups of mice serum IL-17(±s)

表3 三组小鼠血清IL-17比较(±s)Tab．3 The comparison of the three groups of mice serum IL-17(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

.77 Virus group 43.05±8.461) 67.41±10.991)91.24±18.051)Treatment group 41.83±8.41 46.19±14.972)29.51±6.412)3 d 7 d 14 d Control group 13.84±2.19 15.31±1.36 15.29±1 Groups IL-17(ng/L)

表4 三组小鼠血清IL-23比较(±s)Tab．4 The comparison of the three groups of mice serum IL-23(±s)

表4 三组小鼠血清IL-23比较(±s)Tab．4 The comparison of the three groups of mice serum IL-23(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

.41 Virus group 33.07±4.471) 50.41±10.011)66.29±12.131)Treatment group 29.38±3.96 32.61±7.252) 19.59±3.942)3 d 7 d 14 d Control group 10.72±2.05 11.13±1.71 11.12±1 Groups IL-23(ng/L)

表5 IL-17mRNA在小鼠肝脏中的表达情况(±s)Tab．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice(±s)

表5 IL-17mRNA在小鼠肝脏中的表达情况(±s)Tab．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

Groups IL-17/β-action 3 d 7 d 14 d Control group 0.37±0.06 0.37±0.07 0.41±0.05 Virus group 1.23±0.161) 1.67±0.161) 1.94±0.241)Treatment group 1.19±0.15 1.26±0.222) 1.23±0.142)

表6 IL-23mRNA在小鼠肝脏中的表达情况(±s)Tab．6 The expression of IL-23mRNA in the liver of newborn mice(±s)

表6 IL-23mRNA在小鼠肝脏中的表达情况(±s)Tab．6 The expression of IL-23mRNA in the liver of newborn mice(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point;3)P＜0.05，compared with the virus group in the corresponding point.

Groups IL-23/β-action 3 d 7 d 14 d Control group 0.51±0.06 0.50±0.08 0.52±0.08 Virus group 0.75±0.111) 0.84±0.211) 1.03±0.191)Treatment group 0.70±0.12 0.65±0.113) 0.57±0.152)

图2 MCMV感染新生小鼠不同时期肝脏中IL-17mRNA电泳图Fig．2 Images of IL-17mRNA RT-PCR production in the liver of newborn mice

2.6 相关性分析 病毒组、治疗组3、7天时IL-17、IL-23水平与ALT呈正相关(r值为0.691～0.803，P＜0.05)，对照组IL-17、IL-23水平与ALT无相关性(r值为-0.179～0.229，P ＞0.05)。

图4 MCMV感染新生小鼠不同时期肝脏中IL-23mRNA电泳图Fig．4 Images of IL-23mRNA RT-PCR production in the liver of newborn mice

图5 IL-23mRNA在小鼠肝脏中的表达情况比较Fig．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice

3 讨论

Th17是新近发现的一种Th细胞的亚型，能够选择性地分泌一些前炎症细胞因子，主要为IL-17[4]。IL-17是一种重要的炎症介质，通过与其受体(lL-17R)结合，激活T细胞和其他免疫细胞，诱导产生各种细胞因子(如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等)促进炎症反应，同时发现IL-17还参与中性粒细胞、树突状细胞的增殖、成熟及趋化过程，在炎症过程中发挥重要作用[9]。

在一个关于疱疹病毒感染的实验中发现，IL-17通过一个依赖中性粒细胞的程序促使老龄小鼠的死亡，中和IL-17或消耗中性粒细胞均可减少肝损害并降低老龄小鼠的死亡率，而中性粒细胞诱发的肝坏死是疱疹病毒感染死亡的重要原因[10]。Ge等[11]发现慢性乙型病毒性肝炎患者外周血Th17细胞比例及IL-17表达显著升高且与丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平呈正相关，提示Th17细胞与病毒感染后引起的组织损伤和免疫反应有关。Lemmers等[12]研究发现慢性丙型肝炎患者外周血中Th17细胞较正常人明显升高，且可能存在丙型肝炎病毒(HCV)特异性Th17细胞。上述研究，有可能为阐明病毒性肝炎的免疫损伤机制提供依据。

本项目应用MCMV Smith毒株建立MCMV感染小鼠模型，检测其Th17相关细胞因子IL-17的变化规律。结果发现，MCMV感染新生小鼠自感染第3天可检测到血清IL-17水平升高，并维持较高水平，至第14天时达峰值，MCMV感染新生小鼠肝组织IL-17mRNA的表达变化规律与血清相似，3、7天时与ALT呈正相关关系，通过更昔洛韦干预治疗后发现血清IL-17水平、肝组织中IL-17mRNA水平呈下降趋势，治疗7、14天后IL-17的表达显著低于MCMV感染组(P＜0.01)，提示MCMV感染发病过程不同时期都存在已分化的Th17细胞亚群，推测Th17细胞分化可能与新生小鼠MCMV感染发病过程中肝细胞的自身免疫反应损伤有关，表明Th17细胞可能在MCMV感染发病机制中有重要的作用。

IL-23是IL-12家族中的成员，主要通过促进刺激Th17细胞分泌Th17相关的细胞因子IL-17发挥作用[13]。研究发现，IL-23对于维持Th17细胞的功能具有重要的作用，IL-23也是一种重要的促炎因子，在维持和扩增Th17细胞中起重要作用[7]。杨帆等[14]研究结果表明，重组IL-23能明显增加Th17细胞数，伴有IL-17mRNA表达增加及培养上清液中IL-17分泌量增加，提示IL-23在维持Th17细胞增殖及分化中具有重要作用。IL-23主要是通过促进刺激Th17细胞分泌Th17相关的细胞因子IL-17A和 IL-17F 而发挥作用[13]。

本研究发现MCMV感染新生小鼠肝组织中IL-23mRNA和血清IL-23蛋白表达均成阳性，且较对照组小鼠肝脾组织和血清中的表达明显增高(P＜0.01)，在急性期与ALT呈正相关关系，而且通过更昔洛韦干预治疗后发现血清IL-23水平、肝组织中IL-23mRNA水平呈下降趋势，治疗7、14天后IL-23的表达显著低于MCMV感染组(P＜0.01)，提示IL-23可能在MCMV感染的发病中起到了致病作用。在病毒的作用下，抗原呈递细胞DC、吞噬细胞等活化，IL-23p19mRNA表达增加，翻译成蛋白，与同时伴随生成的p40组成具有生物学活性的IL-23，分泌到细胞外发挥其生物学作用。产生的IL-23通过有效的正反馈作用引起巨噬细胞和DC进一步激活，使之产生IL-6、TNF-α等多种促炎物质，增强抗原表达。此外，IL-23还可能激活NK细胞，分泌穿孔素，直接导致肝细胞损伤。

综上所述，Th17相关细胞因子IL-17、IL-23在MCMV感染发病过程中均有高表达，提示Th17相关性细胞因子 IL-17、IL-23可能参与了新生小鼠MCMV肝炎的发病。但其对MCMV感染中Th17细胞的诱导激活、增殖分化调节等地免疫作用机制尚有待于进一步研究。Th17相关性细胞因子在MCMV感染中的研究对T细胞生物学功能及其临床应用开启了新的篇章，对于发现治疗MCMV感染新靶点有深刻意义。

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