丹皮酚抑制小鼠乳腺癌细胞生长作用及机制的研究①

王建杰 闫冬梅 董 航 宋汉君 欧叶涛 商 宇 (佳木斯大学基础医学院，佳木斯154007)

90年代在中药治疗宫颈癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效方剂中均含有牡丹皮，为此人们开始研究牡丹皮的抗肿瘤作用[1，2]。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的活性成分。据报道，丹皮酚对多种肿瘤细胞，如人红白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞BEL-7404以及大肠癌HT-29细胞的增殖等具有抑制作用，并且报道其抗肿瘤机制为诱导细胞凋亡或提高免疫分子的活性，包括减少Bcl-2与Bax的比值，上调 Fas/FasL蛋白的表达和Caspase-3 的表达，调节PTEN/Akt信号通路[3-5]。我们先前的研究表明，丹皮酚能减少乳腺癌小鼠肿瘤组织中p53、Bcl-2以及CerbB-2的表达而抑制肿瘤细胞的生长，从而提示丹皮酚可能通过诱导乳腺癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[6]。本研究通过观察丹皮酚对EMT6乳腺癌小鼠肿瘤组织形态、凋亡指数以及凋亡相关基因的表达，进一步阐明丹皮酚抗乳腺癌的作用及其机制，为传统中药治疗乳腺癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂药品 丹皮酚来自沈阳药科大学提纯分离，纯度 ＞98%。环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)原位凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。兔抗鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体购自福建迈新生物有限公司。Trizol试剂购于Gibco公司，反转录 cDNA合成试剂盒购于大连TaKaRa生物公司，β-actin多克隆抗体来自北京博奥森生物有限公司。

1.1.2 实验动物和细胞株 雌性昆明种小鼠，体重18～22克，购自大连医科大学实验动物中心。自由饮水，清洁级动物饲养房，温、湿度适宜，光照8～10小时/天。小鼠乳腺癌EMT6细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及药物处理 以生理盐水调节小鼠乳腺癌细胞株EMT6浓度至107个/ml，于小鼠右前肢腋下注射0.2 ml/只，共10只，肿瘤长至1 cm时取出，制成5×106个/ml肿瘤细胞悬液，注于小鼠右前肢腋下0.2 ml/只，造模40只，随机分为4组，于接种24小时后，给予不同的药物干预，一组不给予处理作为肿瘤对照组;一组给予CTX(25 mg/kg·d，腹腔注射)作为阳性药物对照组(CTX组)，其他两组分别给予丹皮酚低剂量150 mg/kg，高剂量300 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续14天。每日观察，隔日称重。

1.2.2 肿瘤生长抑制率测定 14天后，次日脱颈处死小鼠，剖取瘤块观察并称重，按公式计算小鼠肿瘤生长抑制率:肿瘤生长抑制率(%)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.3 肿瘤组织细胞形态学的观察 取各组小鼠肿瘤组织0.5cm×0.5 cm大小置于4%中性福尔马林固定液中固定，梯度酒精脱水后，石蜡包埋，组织切片机切片，苏木精、伊红染色，光镜下观察肿瘤组织形态学变化。

1.2.4 肿瘤组织切片的TUNEL染色 石蜡切片常规脱蜡和水合，按照TUNEL试剂盒说明书操作，苏木精复染，漂洗脱水，显微镜下观察。镜下明显的棕黄色颗粒即是凋亡的细胞，而蓝色的细胞提示非凋亡的细胞，图像采集应用Leica图像分析软件，阳性细胞的百分数应用Leica QWin软件进行计算。选择5个随机的视野，每个视野计数100～200个细胞。凋亡指数按公式计算:凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 肿瘤组织中Bcl-2和Bax mRNA表达 应用Trizol法对肿瘤组织中的总RNA进行提取。电泳观察RNA提取结果。1 μg的总RNA用一步法反转录试剂盒转录成cDNA并进行PCR扩增，PCR反应总体积 25 μl，Bcl-2、Bax和 β-actin 引物自行设计合成。Bcl-2引物序列 Forward:5'-CCTGGCACCTGGCGGATAGC-3'; Reverse:5'-CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC-3'长度529 bp。Bax引物序列Forward:5'-GCTCTGACAGATCATGAAGACAG-3';Reverse:5'-CAATCCAA AGTGGACCTGAGG-3'长度746 bp。β-actin序列 Forward:5'-AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3';Reverse:5'-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3'长度 994 bp。Bcl-2 和Bax反应条件:95℃、5分钟，预变性;94℃、30秒，变性;58℃、30秒，退火;72℃、40秒，延伸，扩增30个循环，72℃、10分钟，终末延伸，4℃保温。样品取出后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统扫描分析各条带，依据各条带的光密度和面积对扩增产物进行定量分析，以 β-actin密度作为参考定量标准，计算 Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin 的值。

2 结果

2.1 丹皮酚对小鼠EMT6乳腺癌移植瘤生长的抑制作用 各组小鼠不同药物处理 14天后，发现CTX和低、高剂量的丹皮酚对小鼠移植性肿瘤均显示出明显的抑制作用。模型对照组小鼠的平均肿瘤重量为2.58克，而丹皮酚治疗组和CTX组小鼠平均瘤重分别为1.48(L)、1.23(H)和1.06克(CTX)，比模型对照组明显减少(P＜0.01);丹皮酚治疗组和CTX组的肿瘤抑制率分别是42.64%、52.33%和58.91%。CTX组小鼠体重有所减少，但与对照组相比，无显著差异(P＞0.05)。以上结果表明，CTX与丹皮酚对小鼠EMT6乳腺癌实体瘤具有明显抑制作用(表1)。

2.2 肿瘤组织的形态学观察 小鼠肿瘤组织切片经过HE染色后，镜下观察显示，肿瘤细胞在对照组排列紧密，大小不一，形状各异，胞浆较少，胞核大并深染，以及明显的异型性和异常增生(见图1A)。经过CTX和丹皮酚处理后，肿瘤细胞数目明显减少，核染色质聚集于核膜边缘。核型不规则，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包绕，出现凋亡小体，与对照组相比出现更多的凋亡细胞(见图1B、C)。

表1 丹皮酚对EMT6小鼠的抑制作用(±s，n=10)Tab．1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s，n=10)

表1 丹皮酚对EMT6小鼠的抑制作用(±s，n=10)Tab．1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01，vs control group.

Groups Treatment(mg/kg) Body weight Start End Mean weight of tumor(g) Inhibition rate(%)Control — 19.71±1.84 21.18±2.01 2.58±0.46—52.33 CTX 25 20.96±1.72 19.24±1.20 1.06±0.191) 58.91 Paeonol 150 20.17±1.84 21.65±2.59 1.48±0.241) 42.64 300 20.86±1.74 22.57±2.04 1.23±0.271)

图1 丹皮酚处理后肿瘤组织形态学改变 (H＆E，×400)Fig．1 Morphological changes of tumor tissues in the EMT6 model treated with paeonol(H＆E，×400)

图2 乳腺癌小鼠凋亡形态学和凋亡指数变化(×200)Fig．2 Morphological and apoptotic index changes of apoptosis(×200)

图3 肿瘤组织Bcl-2和Bax mRNA表达Fig．3 Expression of Bcl-2 and Bax in tumor tissues

2.3 肿瘤组织凋亡百分率 应用原位凋亡TUNEL染色特异地检测了各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡的情况。光镜下观察可见，模型对照组可见肿瘤细胞大多染成蓝色，即阴性细胞，仅有少量染成棕黄色的细胞，如图2A所示。与对照组相比，在CTX组和丹皮酚组肿瘤组织切片中出现了更多明显的棕黄色颗粒，见图2B、C。经过图像软件分析，模型对照组肿瘤细胞凋亡率为4.92%，经过CTX和丹皮酚治疗后，凋亡率达到9.94%(CTX)、12.37%(L) 和 21.24%(L)。与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 肿瘤组织Bcl-2和Bax mRNA表达 应用RTPCR方法检测了Bcl-2、Bax的mRNA表达。结果显示，在模型对照组Bcl-2 mRNA呈过表达，Bax mRNA呈低表达，CTX组和丹皮酚组的Bcl-2 mRNA表达明显减弱，而Bax表达却明显增强(图3)。与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

3 讨论

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，我国的发病率正以3%的增长速度逐年上升，2011年上海、北京、重庆等地的乳腺癌发病率占当地女性恶性肿瘤的首位。当前乳腺癌的常用治疗手段主要包括传统的手术治疗以及术后放化疗等，这些手段虽然可以使患者获得较高的生存率，但是乳腺癌术后常在几年内复发。因此，寻找有效的、副作用小的化疗药物尤其重要。乳腺癌化疗药物的开发过程中，传统中药以其安全性高，副作用小，一直受到患者的青睐，也成为国内外众多医学工作者和肿瘤学者研究的方向。

丹皮酚是从牡丹皮中提取出来的小分子酚类物质，对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，因此本文研究了丹皮酚对乳腺癌的作用和分子机制。实验结果表明，丹皮酚能抑制EMT6乳腺癌小鼠肿瘤细胞的增殖，肿瘤细胞形态发生了明显的改变，出现明显的凋亡特征，并测得丹皮酚高剂量组凋亡率为21.24%。由此提示丹皮酚是通过诱导了细胞的凋亡而起到抗乳腺癌作用。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控，许多化疗药物能够诱导肿瘤细胞凋亡，如紫杉醇、顺铂、长春新碱等，诱导肿瘤细胞凋亡也成为肿瘤治疗的一个重要的策略，目前很多药物的开发和研制都把诱导细胞凋亡作为药物疗效的一个衡量指标。细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后细胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式也有所不同，引起的信号转导也不相同。因为细胞类型的不同和药物方面的差异，使药物诱导细胞凋亡的机制非常复杂。尽管目前对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还不够全面，但是，线粒体凋亡途径和细胞表面死亡受体介导的凋亡途径是导致程序性细胞死亡两个主要的途径，而线粒体凋亡途径被公认作为药物治疗癌症的主要途径，在诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥了主要的作用。线粒体凋亡途径主要由Bcl-2家族蛋白介导，在许多的癌细胞中，如宫颈癌、乳腺癌、胃癌等，Bcl-2家族蛋白均出现过表达。Bcl-2主要发挥凋亡抑制因子的作用，阻断细胞色素C的释放，而促凋亡成员(Bax)发挥着促进凋亡的作用。目前认为，二者的作用通常更依赖于在Bcl-2和Bax之间的平衡，而并非依赖于单独的Bcl-2或Bax表达[7，8]。先前的研究显示，丹皮酚能减少乳腺癌小鼠肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达而抑制肿瘤细胞的生长，本实验进一步证明丹皮酚明显减少肿瘤组织中Bcl-2 mRNA表达，而Bax表达却明显增强，进而引起Bcl-2与Bax的mRNA比值下降。由此推测丹皮酚通过抑制或促进了Bcl-2和Bax的基因转录，调节了Bcl-2和Bax蛋白表达，进而导致线粒体释放细胞色素C，启动了线粒体依赖途径。而丹皮酚作用于乳腺癌更详细的分子机制我们将进一步的研究和探讨。

1 孙国平，沈玉先，张玲玲 et al.丹皮酚的体内外抗肿瘤作用[J].安徽医科大学学报，2002;37(3):183-185.

2 潘显道，费勤志，朱承根et al.5个丹皮酚酯的合成和体外抗肿瘤活性研究[J].安徽医药，2004;8(1):16-18.

3 刘长青，谭诗云，计春燕et al.丹皮酚对大肠癌HT-29细胞的增殖抑制作用及其机制的探讨[J].中国药理学通报，2005;21(10):1251-1254.

4 Sun G P，Wang H，Xu S P et al.Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production [J].Eur J Pharm，2008;584:246-252.

5 Borner C.The Bcl-2 protein family:sensors and checkpoints for lifeor-death decisions[J].Mol Immunol，2003;39(11):615-647.

6 Wang J，Li Q，Ou Yet al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma[J].Lat Am J Pharm，2010;9(3):369-375.

7 kirkin V，Joos S，Zornig M.The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis[J].Biochimica et Biophysica Acta，2004;1644:229-249.

8 Takahashi A，Masuda A，Sun M et al.Oxidative stress-induced apoptosis is associated with alterations in mitochondrial caspase activity and Bcl-2-dependent alterations in mitochondrial pH[J].Brain Res Bull，2004;62(6):497-504.