固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺

陈丕英 耿勋 （山东省青岛市饲料兽药检测站 266071）



固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺

陈丕英 耿勋 （山东省青岛市饲料兽药检测站 266071）

本文建立了牛奶中三聚氰胺的固相萃取-高效液相色谱检测方法，经阳离子交换固相萃取柱净化后的样品采用高效液相色谱法测定。结果表明，三聚氰胺的标准曲线为y=44771.2x+4563.8，相关系数r=0.9995，检测限为0.05mg/kg。回收率为97.6%～100.4%。该方法操作简单，精密度和回收率高，可满足奶粉中三聚氰胺的准确定性和定量测定要求。

牛乳 三聚氰胺 固相萃取 高效液相色谱法

2008年9月，我国发生了严重的牛奶中加入三聚氰胺的“三鹿事件”，随后在液态奶、奶糖、雪糕等制品中也相继检测出三聚氰胺。三聚氰胺是一种有机含氮杂环化合物，为重要的化工原料，有良好的绝缘性能和机械轻度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革电器等不可缺少的原料。由于蛋白质主要由氨基酸组成，食品中蛋白质测试方法常采用凯氏定氮法测定总氮来估算蛋白质含量。这种方法只能测定氮的总量，不能识别氮的来源和氮源的种类。三聚氰胺白色粉末，无味，掺杂后不易被发现，常被不法商人用作食品添加剂，以冒充食品中的蛋白质，每100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白质，因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"。

三聚氰胺被摄入人体内遇到胃酸时会溶解，但是排到尿中会再次结合形成结晶，可能堵塞肾小管，随着结晶在体内含量的增多，如果不能排除，积累到一定的程度后形成结石，给肾功能带来极大的损害甚至肾衰竭而死亡。蛋白精给奶制品业带来了巨大的冲击。卫生部等5部门关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告(卫生部公告2011年第10号)要求，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。

目前，三聚氰胺的检测方法主要有：液相色谱法(HPLC)[2]、液相色谱－质谱法(HPLC-MS)[3]、气相色谱－质谱法(GC-MS)[4、5]、毛细管电泳法(CE)、胶体金免疫层析法和酶联免疫法等。2008年10月，国家标准(GB/T22400－2008)中又规定了液相色谱法作为快速检测原料乳及不含添加物的液态乳制品中三聚氰胺的方法[6]。本文采用固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定牛奶中三聚氰胺的含量，利用了HPLC中紫外可见检测器的高灵敏度的特点测定低含量成份，测定时间约为10min，操作简便、灵敏、结果准确。

1 材料与方法

1.1 试剂 色谱纯：甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠。分析纯：三氯乙酸、柠檬酸、氨化甲醇、柠檬酸。离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980ml水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。三聚氰胺标准储备液：称取三聚氰胺标准品0.1g，置于100ml容量瓶中，用水溶解，稀释至刻度，得1000μg·ml－1标准储备液，于4℃避光保存。

1.2 材料 试验所用乳制品为超市购的生乳。

1.3 仪器 高效液相色谱仪(美国water公司)；分析天平；高速冷冻离心机(Heraeus公司)；超声波清洗机(昆山超声仪器公司)；固相萃取装置；QSC-12T氮气吹干仪；涡旋混合器；其它为常规玻璃仪器。

1.4 色谱条件 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相：C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10，体积比)，混匀；流速0.8ml/min；柱温40℃；波长240nm；进样量10μl。

1.5 样品的制备 称取新鲜牛乳5g，加入20ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入5ml2%乙酸铅溶液，均质(2min)或超声20min，10000rpm/min离心10min，取上清液5ml过混合型阳离子交换小柱(PCX)。待样液完全流出后分别用3ml甲醇和3ml水活化固相萃取柱，取上述提取液5ml过固相萃取柱，使提取液以不低于1ml/min的流速通过；分别用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液并将小柱抽干。用5ml5%氨化甲醇(v/v，5ml氨水+95ml甲醇)洗脱，收集洗脱液于试管中在50℃下，用氮气吹干，流动相定容至1ml，过0.2μm滤膜，上机测定。

1.6 标准曲线 移取三聚氰胺标准储备液用乙腈逐级稀释得到的浓度为0.5、1.0、5.0、10、20μg/ml的标准工作液，分别进行高效液相色谱测定，绘制标准曲线。

1.7 样品测定 将生乳样品经1.4处理后在色谱条件下进行分析，测定其峰面积，然后在标准曲线上测定三聚氰胺的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱图

在1.3色谱条件下，得到的三聚氰胺标准样品的色谱图，见图1，走样时间为5min，标准样品保留时间为2min 50s左右。

图1 标准样品色谱图

2.2 标准曲线的绘制与检测限 各种浓度的三聚氰胺工作液高效液相色谱分析结果见表1，以三聚氰胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。得到标准曲线回归方程：y=44771.2x+4563.8，相关系数r=0.9995。结果表明，三聚氰胺在0.5～20μg/ml的浓度范围呈良好的线性关系。在选定色谱条件下，测定三聚氰胺的检测限，结果表明检测限为0.05mg/kg。

表1 不同浓度三聚氰胺标准溶液的峰面积

图2 标准曲线

2.3 精密度和回收率试验 在选定条件下加入3个不同浓度的牛奶三聚氰胺测定添加回收率，每个样品重复测定5次，计算精密度(见表2)。回收率范围为97.6%~100.4%，相对标准偏差为0.56%~1.12%。

表2 回收率的测定 (mg/kg、%)

2.4 样品检测结果 对从市场购买的四个不同品牌的牛奶用建立好的高效液相色谱法进行检测，测得的结果如表3所示。结果表明，4个不同品牌牛奶中所含的三聚氰胺含量均符合国家限量标准。

表3 不同样品中三聚氰胺的测定结果

3 结论

本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺的线性方程，相关系数为0.9995，回收率范围为97.6%~100.4%，相对标准偏差为0.56%~1.12%。该法操作简便、灵敏度和精密度高、检测线性范围宽、回收率稳定，适用于奶站、乳品厂和实验室的快速筛选检测。

[1] 卫生部，工业和信息化部，农业部，工商总局，质检总局．2008年第25号(关于乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值规定的公告) [EB/OL]. http://www.moh.gov.en/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s789/200810/38033. htm.

[2] 王炼, 庞晶晶, 余辉菊. 超高效液相色谱法测定乳及乳制品中的三聚氰胺[J]. 分析试验室, 2010, 29(4): 53-55.

[3] 胡阳, 倪辉, 吴光斌等. 高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量[J]. 集美大学学报(自然科学版), 2010, 15(l): 36-38.

[4] 宗珊盈, 王毅红, 王楠等. 超高效液相色谱一串联质谱法测定乳制品中三聚氰胺的残留量[J]. 分析试验室, 2009, 28(5): 85-87.

[5] Ibaneza M, SanehoJ V, Hemandez F.Determinationofmelamine in milk-based products and other food and beverage produets by ionpair liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 649(l): 91-97.

[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法(GB/T 22388-2008)[S]. 北京:中国标准出版社, 2008.

（2012–12–21）

S859.84

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1007-1733(2013)01-0029-02