乳及乳制品中添加皮革水解物的检测

吴燕 王贞 （山东省青岛市饲料兽药检测站 266071）



乳及乳制品中添加皮革水解物的检测

吴燕 王贞 （山东省青岛市饲料兽药检测站 266071）

本试验采用紫外分光光度计法测定生鲜乳L-羟脯氨酸的含量来确定是否添加皮革水解物，在前处理过程中用硫酸溶液代替了传统中氯化亚锡盐酸溶液水解样品。结果表明，L-羟脯氨酸浓度在0~2.0μg/ml呈良好的线性关系(r=0.9989)，L-羟脯氨酸的回收率为92.8%~100.8%，相对标准偏差为3.02%。本方法测定皮革奶中 L-羟脯氨酸的含量可操作强，重复率好，稳定性高，适合乳及乳制品中皮革水解物的测定。

乳及乳制品 皮革水解蛋白 L-羟脯氨酸 紫外分光光度法

乳品掺假已成为困扰我国乳品工业发展的一个突出问题，在三聚氰胺成为严打的对象后，一些不法企业和奶站便将目光锁定在“皮革水解蛋白”。皮革水解蛋白是利用已经废弃的皮革制品或动物毛发，水解后制成粉末，因而蛋白含量比较高。由于乳及乳制品中蛋白含量要求较高且相对固定，将皮革水解蛋白粉掺入牛奶或奶粉中，再加一些香精、色素等原料而制得的皮革水解产物可提高乳制品中蛋白质的含量，这种奶称为“皮革奶”。皮革奶会改变生鲜乳的口感及氨基酸的组成，降低生鲜乳中氨基酸的吸收利用率，其中含有重金属铬被人体吸收后，积累可导致中毒，关节疏松肿大，造成人体重金属中毒甚至造成婴儿死亡。2009年，卫生部已将皮革水解蛋白公布为《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第二批)[1]。

在常规检测中，试验结果是乳及乳制品中全部蛋白质含量，无法显示乳蛋白的实际含量。所以，添加在乳及乳制品中更为隐蔽，检测难度更大。L(-)-羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为胶原蛋白中的特有组分，而牛奶中不含此氨基酸，因此鉴定L(-)－羟脯氨酸就能鉴定皮革水解蛋白，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，就可判定添加了动物水解蛋白。

因此，为了加强对乳制品的质量安全监督，必须建立一种快速,并且灵敏度较高的检测方法来判断乳制品中有无掺加动物胶原水解蛋白。紫外分光光度法利用羟脯氨酸难挥发，在紫外区有微弱的吸收，没有荧光基团等性质进行检测。胶原蛋白在浓酸或浓碱的条件下，经过高温长时间水解，彻底变成游离的氨基酸。其中的羟脯氨酸首先用氯胺 T氧化生成含吡咯环的物质，然后以高氯酸溶液除去剩余的氯胺T，加入对－二甲基氨基苯甲醛溶液作为显色剂，生成红色化合物，用紫外可见分光光度计测定558nm处的吸光值，从而得到羟脯氨酸的质量浓度[2]。本试验建立紫外分光光度法测定生鲜乳中皮革水解蛋白的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

DV-800紫外可见分光光度计(贝克曼公司)、高速冷冻离心机(Heraeus公司)、水浴锅(上海亚荣生化仪器厂）、DGG-9240A干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。

1.2 试剂

1.2.1 氯胺T溶液 将1.41g氯胺T溶于10ml水中，依次加入10ml正丙醇和80ml缓冲溶液。现用现配。

1.2.2 L-羟脯氨酸标准溶液 （1）L-羟脯氨酸标准储备液(500μg/ml)。精密称取L-羟脯氨酸标准品(国药集团)50mg，用少量0.02mol/l盐酸溶解并定容至100ml容量瓶。（2）L-羟脯氨酸标准工作液(5μg/ml)：吸取L-羟脯氨酸标准储备液5.00ml于500ml容量瓶中，定容。

1.2.3 缓冲液 将50g柠檬酸，26.3g氢氧化钠和146.1g无水乙酸钠(GB694)溶于水，稀释至1L，此溶液与200ml水和300ml正丙醇混合。

1.2.4 氢氧化钠溶液 1mol/L、10mol/L

1.2.5 硫酸溶液 C(H2SO4)≈3mol/L量取750ml水于2L的烧杯中,在搅拌下缓慢加入320ml浓硫酸,冷却至室温后用水定容至2L。

1.2.6 生鲜乳样品 青岛生鲜乳站。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 称取5g样品于100ml锥形瓶中，加入3mol/L硫酸溶液30ml，用表面皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。用滤纸趁热将水解产物过滤至250ml容量瓶中。用3mol/L硫酸溶液10ml分3次洗涤烧瓶和滤纸，合并至容量瓶中。用水定容，摇匀。用移液管吸取25ml该溶液至250ml容量瓶中用水定容。

1.2.2 标准曲线的绘制 分别吸取L-羟脯氨酸标准工作液10ml、20ml、30ml、40ml于100ml容量瓶中，定容。所得的标准工作液浓度分别是0.5、1.0、1.5、2.0μg/ml。取上述不同浓度的溶液5ml于10ml比色管中，加入2ml氯胺T溶液，混匀后于室温下放置20min。再加入2ml显色剂于比色管中，充分混合，将比色管盖上盖迅速放入60℃水浴中，加热20min。取出比色管，用流动水冷却，在室温下放置30min。浓度分别是0.28、0.56、0.83、1.11μg/ml。用紫外分光光度计在558nm波长处测定吸光度，同法用水制备空白。以吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 样品的测定 吸取已制备好的样品液5ml于比色管中，按照1.2.2中的方法进行操作，在558nm波长处测定吸光度。从所得标准曲线上查得其中L-羟脯氨酸的浓度。L-羟脯氨酸的含量计算：

式中：X—样品中L(-)-羟脯氨酸的含量(μg/g)；C—从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量(μg/ml)；m—称取试样的质量(g)；V1—样液体积(ml)；A—稀释倍数。

1.2.4 加标回收率 取6支比色管，每管中均加入5ml牛奶，分别加入适量的L-羟脯氨酸标准储备液，按1.2.1方法处理样品，测定其吸光度，计算加标回收率。

1.2.5 精密度试验 取3个样品，按样品测定方法重复测定6次，测其精密度。

2 结果

2.1 标准曲线

在波长558nm处测定吸光值，做标准曲线(见图1)，得到线性回归方程为：y=0.2532x+0.0018，r=0.9989。由图1可知吸光度与浓度呈良好的线性关系，线性范围是0~ 2.0μg/ml。

表1 标准曲线方程制备

图1 L-羟脯氨酸标准曲线

2.2 加标回收率

按样品测定方法测定回收率结果见表2，由表2可以看出其加标回收率在92.8%~100.8%之间，相对标准偏差为3.02%，本试验准确度是符合分光光度计的实验要求的。

表2 L-羟脯氨酸回收率 (μg/ml、%)

2.3 精密度试验

3个试样分别重复做5次做精密度实验检测结果见表3，相对标准偏差为0.81%~1.46%，符合试验精密度的实验要求。

表3 精密度试验

3 结论与讨论

目前的国家标准中还没有乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸的检测标准，大部分的检测方法引用的是已经作废的国家标准GB/T 9695·23-1990《肉与肉制品L(-)-羟脯氨酸含量测定》(简称90版)。此方法与90版区别是样品的前处理方法，是用硫酸溶液代替氯化亚锡的盐酸溶液。因为盐酸易挥发，水解过程中必须水浴加热16h，用冷凝装置再回流。用硫酸水解不易挥发，只用普通烧杯即可，操作简单可行。

本试验测定乳或乳制品中羟脯氨酸，其回收率在92.8%~100.8%之间,精密度试验的相对标准偏差为0.81%~ 1.46%，检测条件稳定，加标回收率高，变异系数较小，其准确度和精密度均较好，仪器要求低，应用简单方便，所以此方法可以检查乳或乳制品中是否含有L-羟脯氨酸，对生鲜乳中皮革水解蛋白鉴定标准的制定提供可靠的实验室数据及科学依据。

[1] 黄文水, 吴丽萍. “皮革奶”中L-羟脯氨酸的测定[J]. 光谱实验室. 2011, 28(6): 3094-3096.

[2] 中华人民共和国国家质量监督检验和检疫总局和中国国家标准化管理委员会国家标准. GB/T 9695.23-2008. 肉与肉制品羟脯氨酸含量测定[s]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

（2012–12–20）

S859.84

A

1007-1733(2013)01-0027-02