HP-PRRSV原始株在抗体压下传代突变株抗原性及致病力变化研究

范书金 （山东省聊城市动物医院 252000） 肖延光 赵爱民 魏雅茹 王素红（山东省聊城市畜牧站）



HP-PRRSV原始株在抗体压下传代突变株抗原性及致病力变化研究

范书金 （山东省聊城市动物医院 252000） 肖延光 赵爱民 魏雅茹 王素红（山东省聊城市畜牧站）

为了比较高致病性蓝耳病山东分离株SD0612原始株及其在抗体选择压下突变株在回归猪体后的抗体动态变化，试验中，将15头健康猪分为5组，分别为SD0612原毒感染组、有抗体条件下第1次传40代突变株F40感染组及有抗体条件下再次传40代突变株e40感染组、无抗体条件下再次传40代突变株a40感染组及阴性对照组，分别于接毒后1周、2周、3周、4周、5周采血，收集血清以ELISA试剂盒测定其抗体水平。剖检死亡猪及到期剖杀猪，取病料固定，石蜡切片，HE染色，镜检。结果显示：F40在接种猪后引起的ELISA抗体较原始株迟缓，约滞后1周左右。而e40和a40诱发的抗体和F40未见明显区别。4个毒株比较后发现，SD0612原始株感染猪后引发的ELISA抗体始终是最高的，显示其在体内的复制能力最强和抗原性最好。

高致病性蓝耳病 分离株 抗体水平 免疫原性

我国于1995年在北京地区首次大规模暴发PRRS，郭宝清等于1996年首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离到PRRSV CH-1a株，证实了我国存在此病(郭宝清等，1996)，并相继分离出BJ-4、HN1、HB-1、HB-2、SD、DQ和SA等多株PRRSV，且对其来源和遗传学背景进行了探讨。目前，国内至少有22个省份报道过有本病的发生或流行，成为规模化养猪场的主要动物疫病之一。发病快、死亡率高、流行速度快、强度大、抗生素治疗效果差或根本无效。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM干粉购自INVITROGEN公司，用于细胞培养液的制备。胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司。甲醇、丙酮、甲醛、二甲苯等均为国产分析纯，检测PRRSV抗体的ELISA试剂盒购自美国IDEXX公司，莱卡石蜡切片机，苏木素、伊红染液。

1.2 HP-PRRSV原始毒株-SD0612 HP-PRRSV原始毒株SD0612为山东农业大学崔治中教授实验室分离的野毒株，NSP2的分析显示该毒株为NSP2缺失90bp的强毒变异株。测定TCID50后冻存于-80℃超低温冰箱备用。

1.3 SD0612在抗体压下的传代毒株 将Marc-145培养于6孔板中，待细胞长满单层后接毒，20ml/孔。6孔板第一行为系列I，培养液中添加10%阴性对照猪血清，又分为A、B、C三个平行的传代系列；第二行为系列II，即培养液中含有10%的抗血清，又分为D、E、F三个平行的传代系列。待细胞75%~80%出现病变时收获病毒分装冻存于-80℃冰箱。按上述分组对应接种下一个六孔板，依次对应传代，连续传代40代后得到各系列的传代毒株A40-F40。

将上述传代毒F40制备抗血清并按上述方法在新的抗体选择压下再连传40代，得到新的传代毒a40-f40。

试验选取F40、a40及e40传代毒株，毒株由山东农业大学崔治中教授研究室提供。

1.4 传代毒株回归试验动物 购买健康一月龄长白猪15头，由齐鲁动物保健品有限公司提供。经检测PRRSV、PCV-2、PPV、CSFV等均为阴性且PRRSV抗体为阴性。

表 试验动物分组及处理

编号组 别处理 A-1-3SD0612原始株接种组2×104TCID50/头 B-1-3第1次传代有抗体组突变株F40接种组6×106TCID50/头 C-1-3第2次传代有抗体组突变株e40接种组6×106TCID50/头 D-1-3第2次传代无抗体组突变株a40接种组6×106TCID50/头 E-1-3空白对照组等体积PBS

1.5 接毒猪的临床症状观察及血常规变化检测 接种毒株后每日定期测量各组实验猪的体温变化，仔细观察临床表现。以2ml无菌注射器吸取0.2ml肝素抗凝剂，然后于接毒后1、2、3、4、5周采血，每头猪采血0.8ml，混匀后以全自动血细胞分析仪测定血常规。

1.6 接毒猪不同时期ELISA抗体检测 应用IDEXX试剂盒检测血清PRRSV抗体，严格按说明书操作。

1.7 接种毒株后试验猪剖检病变及病理组织学变化 对试验期间死亡的及5周到期剖杀的试验猪剖检，仔细观察其眼观病变，并取肺、脾、淋巴结、扁桃体、脑、肝、胃肠道等器官组织，10%的中性福尔马林溶液固定，按常规方法制造石蜡切片，HE染色，光镜下观察病理组织学变化。

2 结果

2.1 接毒猪临床表现 （1）SD0612接种组：接种第2天体温升至40~41.8℃，高热稽留，临死前1d体温才开始下降，精神沉郁，喜卧；采食量下降或食欲废绝，粪干；皮肤紫红，耳部和四肢末段发绀，睾丸红肿，有的皮肤表现点状出血；呼吸困难，部分出现严重的腹式呼吸，有的表现喘气或呈不规则呼吸；后期有鼻液或出血，部分患猪流清鼻涕，打喷嚏、咳嗽、眼分泌物增多，大部分猪有泪斑，出现结膜炎症状；有的猪便秘，粪便呈球状，有的猪下痢，尿黄而少、混浊，发病2周左右病猪迅速死亡；有的病猪后肢无力，病猪濒死前不能站立，有神经症状，最后全身抽搐而死。死后呈败血症变化。（2）F40、e40、a40接种组：传代突变株接种后均未出现明显的临床症状，个别猪接种后2~3d体温稍升高达40℃，随后很快恢复正常。（3）空白对照组：体温及临床表现均未见异常变化。

2.2 接毒猪血常规变化 SD0612原始株感染后白细胞总数显著升高，3周时达到高峰，4周时开始下降。其血红蛋白含量显著下降，远低于参考范围，在3周时达到最低，4周时开始上升。可以看出SD0612原始株感染后诱发较强的免疫反应。而F40、e40及a40引起的血常规变化与原始株相似，但相对缓和。

2.3 接毒猪PRRSV抗体变化规律 四组接毒后PRRSV抗体水平逐步升高，不同的是SD0612原始株在第3周龄时即达到高峰，而F40、e40及a40感染组在第4周龄时才达到高峰，相对于原始株迟缓1周左右。

2.4 接毒猪的剖检病变 （1）SD0612接种组：肺脏严重充血、暗红色实变，有的可见细菌感染引发的胸膜炎和心包炎。全身淋巴结充血、肿胀，切面外翻、湿润呈浆液性淋巴结炎病变，病情严重的病例全身淋巴结见出血性炎症、切面呈大理石样变。病变最为严重的是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结。脾暗红色肿大，表面常见米粒大出血丘疹。扁桃体充血、出血、肿胀。肝暗红色肿大，或呈土黄色、质脆，胆囊扩张或萎缩，胆汁浓稠。肾充血肿大，见点状出血，膀胱积尿，尿呈棕黄色。（2）F40、e40及a40接种组：3组均未见明显的眼观病变，个别猪肺色暗红稍显硬实，肝色淡稍肿胀。（3）对照组：未见异常病变。

2.5 接毒猪病理组织学变化 （1）SD0612接种组：肺呈弥漫性、重度性间质性肺炎，因大量巨噬细胞、淋巴细胞浸润增生，肺泡壁显著增厚，肺小叶间质显著增宽。支气管及血管周围炎性细胞呈围管样增生。脑均有不同程度的病毒性脑炎病变，可见明显的血管袖套现象、卫星现象、嗜神经现象，神经元变性坏死，胶质细胞呈弥漫性或结节状增生，软脑膜下充血、出现，大量淋巴细胞浸润。脾、淋巴结及扁桃体轻度充血、出血、淋巴细胞坏死。肝、肾、心等实质器官普遍发生颗粒变性和水泡变性。（2）F40接种组：2头猪的肺泡壁轻度增厚，淋巴细胞浸润，肝细胞轻度颗粒变性及水泡变性，心肌轻度颗粒变性，猪脑血管充血，少量淋巴细胞浸润；胸腺、扁桃体、脾及淋巴结均未见明显的病理组织学变化，胃肠道未见明显病变。（3）e40接种组：1头猪的肺泡壁轻度增厚，淋巴细胞浸润，肝细胞轻度颗粒变性及水泡变性；其它组织器官未见明显病变。（4）a40接种组：1头猪的肺泡壁轻度增厚，淋巴细胞浸润，肝细胞轻度颗粒变性及水泡变性，心肌轻度颗粒变性，猪脑血管充血，少量淋巴细胞浸润；胸腺、扁桃体、脾及淋巴结均未见明显的病理组织学变化，胃肠道未见明显病变。（5）对照组：未见明显病变。

图1 F40接种组病理学变化

图2 e40接种组病理学变化

图3 a40接种组病理学变化

3 讨论

（1）病毒在细胞的长期自然传代中，其复制能力和致病性会发生一些变化，这两方面往往是相互影响的。很多弱毒疫苗即是由强毒经多次传代致弱后而来。而这些传代均是在无抗体的情况下的自然传代，对于PRRSV在有抗体情况下传代后病毒的致病性和抗原性的变化尚未有研究报道。前期研究中发现，PRRSV在有抗体传代情况下其ORF3和ORF5基因会发生很多的有义突变，通过血清交叉中和试验发现病毒在抗体选择压下抗原性发生了改变。不同代次的基因突变毒株其毒力是否也同样会发生明显改变，是否还保留原有的抗原性，这两个需注意问题。因此对PRRSV原始株及其在抗体压下不同传代株在回归猪体后的抗体动态变化规律及病理学变化进行了比较研究。（2）结果显示，SD0612在有抗体情况下连续传代40代后的突变株F40在接种猪后引起的ELISA抗体较原始株迟缓，约滞后1周左右。而F40在有抗体或无抗体情况下连续传代40代后的突变株e40和a40诱发的抗体和F40未见明显区别。4个毒株比较后发现，SD0612原始株感染猪后引发的ELISA抗体始终是最高的，显示其在体内的复制能力最强和抗原性最好。而突变株的抗原性稍有变化，这种变化是否会影响其免疫保护作用，有待于进一步实验验证。（3）SD0612原始株接种组迅速出现高致病性蓝耳病的典型病症，于接种10~13d后死亡，剖检及病理组织学病变也完全符合高致病性蓝耳病的典型病变。而3株突变株除一过性发烧外，未见其它症状，剖检也未见明显的眼观病变，但镜检1/3的猪见肺泡壁轻度增厚，少量淋巴细胞浸润，肝细胞轻度颗粒变性及水泡变性，各毒株间未见明显的差异，表明突变株的致病力显著下降，已成“非致病性”弱毒株，但安全性还是存在一定的隐患。致弱突变株回归猪后其毒力是否还会返强，这也是需注意的问题，有待于进一步验证。

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（2012–07–13）

S813.3

A

1007-1733(2013)01-0011-03