乳酸菌发酵小米糠生产γ-氨基丁酸的配方和条件优化＊

蒋冬花，高爱同，毕 珂，谢祥聪，陈 璨

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

小米是我国北方的主要小杂粮之一，具有“百谷之首”的美誉.小米糠是小米加工过程的副产品，占小米质量的6%～8%.按照我国小米年产量500 万t 计算，每年加工小米将产生小米糠40 万t 左右.研究表明，小米糠中含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、维生素、矿物质等营养素，以及生育酚、亚油酸、γ-谷维醇、植物甾醇、神经酰胺等生理活性物质.因此，小米糠在国外被誉为“天赐营养源”［7-8］.在我国，小米糠绝大多数被用作低附加值的禽兽饲料或提取小米糠油［9］，利用率颇低，深加工产品较少，未将其所具有的营养价值和资源效益充分发挥，浪费了这一大自然资源.联合国工业发展组织称其为“一种未充分利用的工业原料”［10］.目前，已有发酵稻米糠生产GABA 的研究报道［11-12］，但以小米糠为培养基原料、通过乳酸菌发酵合成GABA 的研究尚未见报道.

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，有帮助消化、有助于人体肠道健康等功能，常被视为健康食品.因此，利用乳酸菌生产的GABA 能达到食品安全级，并可进一步丰富乳酸菌作为益生菌的保健功效，具有广阔的应用范围和市场前景［4，13］.

本研究以廉价的农副产品小米糠为原料，L-谷氨酸钠(L-MSG)为合成底物，通过短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株发酵生产GABA.为有效利用小米糠这一农副产品资源提供一种新方式，也为GABA 的生产提供一种新方法.

1 材料与方法

1.1 菌种及小米糠

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株，由本实验室从酸菜［13］中筛选，其特点为高产GABA.该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC NO:M 209132.

小米糠:由山东省济宁市金乡国昌果蔬有限公司提供.

1.2 培养基

1)琼脂试管斜面培养基:酵母膏10 g，葡萄糖15 g，碳酸钙15 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株的保藏.

自编软件在水利工程设计单位科技档案管理中的应用………………………………… 刘文君，单 洁，汤 杰(12.44)

2)改良MRS 培养基:蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸钠2 g，柠檬酸二胺2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，吐温80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株的活化.

3)GYP 种子培养基:胰蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，丁二酸钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株发酵种子的制备.

4)不同含量小米糠培养基:小米糠10～80 g/L，L-谷氨酸钠20～60 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 4.00.用于L2 菌株发酵合成GABA.

1.3 主要仪器设备与试剂

Universal 32R 台式高速冷冻离心机(德国Hettich 公司);Milli-Q Academic A10 超纯水系统(美国Millipore 公司);PB-10 pH 酸度计(德国Sartorius 公司);LRH-250 生化培养箱(上海一恒公司);PB-10 电子天平(德国Sartorius 公司);SA-960-2 生物洁净工作台(上海上净净化设备有限公司);1200 型高效液相色谱仪(美国Aglient 公司);Kromasil C18高效液相色谱柱(美国Thermo公司).

GABA 标准品(美国Sigma 公司);丹磺酰氯(美国Fluka Chemie AG 公司).所用药品试剂均为分析纯，乙腈为色谱纯.

1.4 菌株的活化和发酵种子的制备

从冰箱中取出L2 菌株试管斜面保存菌种，室温静置1 h，从斜面上取2 环菌体接入50 mL 改良MRS 液体培养基中，30 ℃静止活化培养16 h.取一环菌种转接到GYP 种子培养基中，培养24 h用作发酵种子.

1.5 发酵参数的优化

1.5.1 培养基初始pH 的优化

将小米糠培养基(小米糠50 g/L，L-谷氨酸钠20 g/L)用1 mol/L 碳酸氢钠溶液和1 mol/L 柠檬酸溶液调成不同的培养基，初始pH 值分别为3.00，3.60，4.00，4.40，4.60，4.80，5.00，5.20，5.40，5.60，5.80，6.00 和6.20，然后按体积比3%接种量接入种子液，30 ℃静止培养24 h，用高效液相色谱仪测定发酵液中GABA 的含量.

1.5.2 培养温度的优化

将小米糠培养基(同上)初始pH 调成4.00，按体积比3%接种量接入种子液，分别在4，10，20，30，40，50，60 和70 ℃共8 个温度下静置培养24 h，用高效液相色谱仪测定发酵液中GABA 的含量.

1.5.3 培养时间的确定

将小米糠培养基(同上)初始pH 调成4.00，按体积比3%接种量接入种子液，30 ℃静止培养108 h，期间每6 h 取样测定发酵液pH 变化和GABA 的含量.

1.5.4 底物L-谷氨酸钠质量浓度的优化

将含不同质量浓度L-谷氨酸钠的小米糠培养基(含小米糠50 g/L，L-谷氨酸钠分别为20，30，40，50 和60 g/L)初始pH 调成4.00，按体积比3%接种量接入种子液，30 ℃静止培养72 h，用高效液相色谱仪测定含不同质量浓度L-谷氨酸钠发酵液中GABA 的含量.

1.5.5 小米糠加入量的优化

将种子液以体积比3%的接种量接种到不同含量小米糠培养基(小米糠添加量为10～80 g/L，L-谷氨酸钠50 g/L，初始pH 4.00)中，30 ℃静止培养72 h，用高效液相色谱仪测定含不同加入量小米糠发酵液中GABA 的含量.

1.6 GABA 定量分析

用高效液相色谱(HPLC)法测定GABA 的产量.具体操作方法如下:发酵液5 000 r/min 离心后，上清液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取10 μL 于2.5 mL 离心管中，加入衍生缓冲液100 μL、衍生剂(2，4-二硝基氟苯)100 μL 和定容缓冲液790 μL，混匀，60 ℃水浴1 h，20 μL 进样.色谱条件为:流动相由流动相A 与流动相B 按体积比为2 ∶1组成，流动相A 为乙酸钠溶液和水，流动相B为乙腈;流速为0.5 mL/min;柱温为室温;色谱柱为Kromasil C18柱;检测波长为338 nm.

2 结果与分析

2.1 培养基初始pH 对L2 菌株GABA 合成的影响

在pH 3.00～6.20 设置了13 个小米糠培养基初始pH，30 ℃培养24 h 后，分别检测产物GABA和底物L-谷氨酸钠含量的变化，结果如图1所示:L2 菌株在pH 3.00～6.20 均能发酵产生GABA，但pH 对GABA 的产量有显著的影响.在pH 3.00～4.00，随着pH 值的增大，GABA 的产量快速升高;当pH 值大于4.00 时，随着pH 值的增大，GABA 的产量又逐渐降低.底物L-谷氨酸钠的质量浓度的变化与之相反.pH 值小于3.00 及大于6.20 时，GABA的产量均很低.在pH 值为4.00时，GABA 的产量达到最大值，为10.316 g/L.表明偏酸性环境较适宜L2 菌株合成GABA.

图1 初始pH 对小米糠培养基上L2 菌株产GABA 的影响

2.2 培养温度对L2 菌株GABA 合成的影响

培养温度对短乳杆菌L2 菌株GABA 合成的影响见图2.L2 菌株发酵生产GABA 的温度以30 ℃为宜.

图2 培养温度对小米糠培养基上L2 菌株产GABA 的影响

2.3 培养时间对L2 菌株GABA 合成的影响

培养时间对短乳杆菌L2 菌株发酵液pH 及GABA 合成的影响见图3.随着发酵时间的延长，发酵液pH 值在0～12 h 略有减小;但随着GABA的合成，发酵液pH 值逐步增大;在发酵72 h 时，发酵液对应的pH 值和GABA 的含量分别为6.41及28.247 g/L.当发酵液pH 值大于6.20 时，已不适合GABA的合成.因此，适宜的发酵时间确定为66～72 h.

图3 培养时间对小米糠培养基pH及L2 菌株产GABA 的影响

2.4 L-谷氨酸钠含量对L2 菌株GABA 合成的影响

L-谷氨酸钠含量对短乳杆菌L2 菌株GABA合成的影响见图4.随着L-谷氨酸钠质量浓度的增加，GABA 的产量也逐渐提高.当L-谷氨酸钠质量浓度为50 g/L 时，GABA 的产量达到最高.L2菌株发酵生产GABA 适宜的底物L-谷氨酸钠质量浓度为50 g/L.

图4 不同含量L-谷氨酸钠对小米糠培养基上L2 菌株产GABA 的影响

2.5 小米糠添加量对L2 菌株GABA 合成的影响

不同含量小米糠培养基(小米糠添加量为10～80 g/L，L-谷氨酸钠50 g/L，初始pH 4.00)对L2 菌株GABA 合成的影响见图5.随着小米糠添加量的增加，GABA 的产量也逐渐提高.当小米糠含量达到70 g/L 时，GABA 的产量达最高，为32.037 g/L.

图5 小米糠添加量对L2 菌株产GABA 的影响

图6 发酵液中GABA 的高效液相色谱图

图7 发酵液中纯化的GABA 透明针状结晶

发酵液经高效液相色谱分析GABA，代表性图谱见图6.发酵液经分离纯化、洗脱、浓缩和结晶等步骤后，可得GABA 透明针状结晶(见图7).

3 讨论

本研究以廉价的农副产品小米糠为原料，L-谷氨酸钠(L-MSG)为合成底物，通过短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株发酵生产GABA.将小米糠这一农副产品作为乳酸菌培养基进一步开发利用，相对于常规乳酸菌发酵生产GABA 使用的MRS 发酵培养基［6］，小米糠培养基具有配方简单(只含有小米糠和底物L-谷氨酸钠)、原料价格低廉、纯天然、无污染等优点，大大地降低了生产成本，从而增强了工业生产的经济可行性和市场竞争力，对于用乳酸菌发酵生产GABA 的产业化具有重要的现实意义和广阔前景，并为有效利用小米糠这一农副产品资源提供了一种新的方式;将小米糠开发为富含GABA 的保健功能食品，对减少资源浪费，提高农产品附加值具有重要意义.

本研究通过单因子实验优化了小米糠培养基上L2 菌株发酵生产GABA 的过程中pH、培养温度、培养时间、小米糠及底物添加量等因素，获得了优化培养基组分为:小米糠70 g/L，L-谷氨酸钠50 g/L，优化发酵条件为:培养基初始pH 4.00，30 ℃培养66～72 h.在优化的培养基组合和发酵条件下，发酵液中GABA 的产量可达32.037 g/L.该产量属于目前国内外生产GABA 较高的产量［4，6］.

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