响应面法优化副干酪乳杆菌增菌培养基

杨丽娟，陆海燕，贝丽霞，韩文革，赵长江，韩德权

（1. 黑龙江八一农垦大学农学院，大庆163319；2. 黑龙江大学生命科学学院）

副干酪乳杆菌是一种益生菌，其冻干菌粉可直接应用于家庭及工厂的蔬菜发酵中。用副干酪乳杆菌发酵蔬菜的亚硝酸盐含量远低于自然发酵蔬菜，并且使用方便，产品质量稳定。在家庭以及工厂规模化生产中拥有广阔的市场前景。而在基础培养基中副干酪乳杆菌菌体产量低。采用响应面法对副干酪乳杆菌培养基进行优化，旨在提高菌体密度为工业化生产蔬菜发酵剂提供必要的参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种：副干酪乳杆菌（由实验室分离并保藏）

试剂：葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨均为分析纯。

仪器：SW-CJ-1FD 洁净工作台，LRH-250 生化培养箱，TDL-5 型台式离心机，YXQ-SG46-280SA高温灭菌锅，752 型紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

碳源筛选：将副干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS 液体培养基中，培养基组分氮源固定为2%酵母膏；碳源分别选择葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖[1-2]，接种后在37 ℃培养24 h，测定OD600值并计算含菌量。

氮源的筛选：将副干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS 液体培养基中，培养基组分碳源固定为2%葡萄糖；氮源分别选择酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨[3-4]，接种后在37 ℃培养24 h，测定OD600值并计算含菌量。

1.2.2 培养基优化

Plackett-Burman 试验：从单因素试验确定的最佳碳源（蔗糖），最佳氮源（酵母膏）以及缓冲盐中筛选出对副干酪乳杆菌菌体密度有显著影响的因素，实验设计见表1，接种量5%，37 ℃培养24 h，测定OD600值。

最陡爬坡试验：最陡爬坡法是寻找最优区间的一种方法，可以最大限度接近最佳值，确保响应值的准确性[5]。对Plackett-Burman 试验筛选出的主要影响因子进行实验，对产生正效应的因子增加用量，产生负效应的因子减少用量。

中心组合试验：对Plackett-Burman 试验筛选出的对响应值影响显著（P＜0.05）的因素，通过SAS 软件进行分析计算，预测最大响应值及与响应值相对应的各变量值，并按预测结果进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源筛选

副干酪乳杆菌对不同碳源的代谢能力不同，不同的碳源对菌体生长速度和最终密度都有很大影响。因此，选择合适的碳源对菌体增殖培养是十分重要的。研究选取对乳酸菌增菌培养有较好作用的碳源，蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖，并分别对其进行单因素试验，确定最佳碳源及浓度，其中氮源固定为2%酵母膏。

由图1 可知，随着糖浓度的增加菌体密度均有不同程度提高，其中碳源为葡萄糖或蔗糖时，随着糖浓度的增加菌体密度提高幅度较大。蔗糖浓度为9%时菌体密度最大（40×108cfu·mL-1）。因此选择蔗糖作为副干酪乳杆菌增菌培养基的碳源。

2.1.2 氮源筛选

氮源是副干酪乳杆菌生长必不可少的营养元素，不同的氮源对菌体密度也有较大影响。因此，选择合适的氮源对菌体增殖培养是十分必要的。分别选取对乳酸菌增菌培养有较好作用的牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨进行单因素试验，确定最佳氮源及浓度，其中碳源固定为2%葡萄糖。

图1 糖浓度对菌体密度的影响Fig.1 Effect of the Sugar concentration on density

图2 氮源浓度对菌体密度的影响Fig.2 Effect of the nitrogen source concentration on density

由图2 可知，随着氮源浓度的增加，菌体密度不断提高，其中以酵母膏增菌效果最为明显当酵母膏浓度2.5%时，菌体密度达到最大值6.05×108cfu·mL-1。酵母膏是常用氮源，价格低廉，易于被乳酸菌所利用，所以酵母膏较为适于作为副干酪乳杆菌增菌培养基中的氮源。

2.2 Plackett-Burman 试验筛选主要影响因素

通过对几种碳源、氮源的筛选，可以使菌体找到最佳营养条件，从而提高菌体密度。通过Plackett-Burman 试验对以上单因素试验筛选出的碳源、氮源及对乳酸增菌培养有辅助作用的无机盐进行筛选，选出对菌体增殖有显著影响的因素，进而确定响应面优化对象。随着培养过程中乳酸的不断积累，pH值下降，菌体的增殖会受到限制，因此，在乳酸菌培养基中添加缓冲盐来缓解pH 值下降，从而使菌体密度达到最高[6]。选择对乳酸菌增殖培养有显著影响的缓冲盐：磷酸氢二钾、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸锰、硫酸镁及吐温作为筛选因素，加上单因素试验选出的最佳碳源、氮源共8 个因素进行Plackett-Burman 试验，从这8 个因素中筛选出对增菌培养有显著影响的因素[7-8]。

选用N=12 的Plackett-Burman 试验设计，对蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸锰、硫酸镁及吐温8 个因素进行研究，每个因素分别选取-1，+1 两水平。试验设计及结果如表1 所示，8 个因素所代表的参数水平以及分析结果见表2。

表1 Plackett-Burman 试验设计及结果Table 1 Plackett-Burman design and results

由表2 中的t 检验可知，对结果产生正效应的因素为蔗糖、酵母膏、乙酸钠和吐温80，产生负效应的因素为磷酸氢二钾、柠檬酸钠、硫酸锰和硫酸镁。蔗糖和酵母膏在99%的水平上对响应值的影响显著，硫酸镁在95%的水平上对响应值的影响显著，其他因素对响应值影响程度较小，所以选取蔗糖、酵母膏和硫酸镁这3 个因素作为中心组合试验的研究对象。其中负效应的因素固定在－1 水平，正效应的因素固定在+1 水平。

表2 Plackett-Burman 试验分析结果Table 2 Analysis and results of Plackett-Burman

碳源是乳酸菌生长的重要营养物质，氮源是乳酸菌中蛋白质、核酸的物质来源，是乳酸菌生长不可缺少的营养元素[9]。筛选结果表明，碳、氮源是影响乳酸菌生长的最重要影响因子。硫酸镁作为无机盐有助于乳酸菌生长，并对乳酸菌发酵产生的乳酸起到缓冲作用，进而减缓乳酸过度积累而抑制菌体增殖的现象。

2.3 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察的邻近领域里才能充分近似真实情况，在其他区间里，拟合方程与被近似的函数方程无相似之处，所以拟合是毫无意义的[10]。因此，必须最大限度的逼近最大菌体密度区域后才能建立有意义的响应面拟合方程。最陡爬坡法是以试验值变化梯度方向为爬坡方向，以各因素的效应值大小来确定步长变化，能够有效地逼近最大菌体密度区域。

根据Plackett-Burman 试验分析的结果确定下一步试验，即最陡爬坡试验的研究对象。从表2 中可知，蔗糖、酵母膏有显著正效应，在爬坡试验中用量应增加；硫酸镁有显著负效应，在爬坡试验中用量应减少。试验设计及结果见表3，从表3 中可以清楚地看出，4 号试验蔗糖、酵母膏、硫酸镁质量浓度分别为9.6%、2.65%、0.027%时，菌体密度达到最大值，然后随着质量浓度的变化菌体密度不断降低。4 号试验的质量浓度接近最大响应区域，所以研究利用该质量浓度作为中心组合试验的中心点。

表3 最陡爬坡试验及结果Table 3 The results of steepest climbing test

2.4 响应面试验

根据最陡爬坡试验可知，响应变量Y 值逼近菌体密度最大值，以4 号试验条件作为中心点进行中心组合试验，中心组合试验设计及响应值结果如表4和表5 所示。

表4 中心组合试验中变量及其水平Table 4 Factors level of the central composite response test

以菌体密度Y1为因变量，因素X1，X2，X7为自变量的回归方程为：

利用F 检验评价方程，得到概率水平在99%的条件下回归是显著的（P<0.000 1）。方程的确定系数R2=94.69%，这说明94.69%的试验数据可以用这个方程解释。图3、图4 和图5 显示方程的三维响应面，证实了拟合面有真实的最大值。

通过软件计算得到，当蔗糖质量浓度为9.50%，酵母膏质量浓度为2.73%，硫酸镁质量浓度为0.027%时，菌体密度达到了最大值5.18×109。为了验证预测值，在这个点进行了3 次重复实验，得到菌体密度的平均值为5.16×109，与数学模型得到的最大菌体密度数据有较好的吻合，这说明响应面法优化得到的数学模型与实验数据拟合的较好。

表5 中心组合设计及试验结果Table 5 The results of central composite response test

图3 蔗糖与酵母膏交互作用对菌体密度影响的响应面图（A）和等高线（B）Fig.3 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Sucrose and Yeast extract on density

图4 蔗糖与硫酸镁交互作用对菌体密度影响的响应面图（A）和等高线（B）Fig.4 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Sucrose and Dipotassium hydrogen phosphate on density

图5 酵母膏与硫酸镁交互作用对菌体密度影响的响应面图（A）和等高线（B）Fig.5 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Yeast extract and Dipotassium hydrogen phosphate on density

3 结果与讨论

副干酪乳杆菌增菌培养基的优化过程中，首先通过单因素试验确定最佳碳源、氮源，然后通过Plackett-Burman 设计研究了培养基各组分对菌体密度的影响程度，找出了影响显著的3 个因素蔗糖，酵母膏，硫酸镁。然后通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域。最后设计中心组合实验，拟合出一个三元二次多项式方程，找出了最佳值。最佳配方为蔗糖9.50%、酵母膏2.73%、硫酸镁0.027%、柠檬酸钠0.3%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸锰0.01%、吐温0.05%，得到最大菌体密度5.16×109。实验中的碳源采用了蔗糖，增菌效果优于张建友等人[11]的菌体密度优化结果108，不仅大幅度提高了菌体密度，而且由于蔗糖价格低廉，有利于工业化大规模生产。酵母膏是一种较易于乳酸菌利用的氮源，是乳酸菌中蛋白质、核酸的物质来源，是乳酸菌生长不可缺少的营养元素[12]。硫酸镁作为无机盐有助于乳酸菌生长，并对乳酸菌发酵产生的乳酸起到缓冲作用，进而减缓乳酸过度积累而抑制菌体增殖的现象。

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