超声波辅助热水浸提黑木耳多糖工艺的优化研究

包鸿慧，于婷婷，盛倩，刘方媛，周睿，杨宏志

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

黑木耳（Auricularia auricular）是我国重要的传统药食兼用保健型食用菌，其主要生物活性组分——黑木耳多糖，具有调节免疫力、降血脂、降血糖、抗溃疡、抗凝血、抗肿瘤、抗衰老、抗肝炎、抗突变、抗辐射、抗氧化、增强肠胃功能、促进血清蛋白生物合成和促进淋巴细胞核酸生物合成等生理功效，备受国内外广泛关注[1-5]。

传统黑木耳多糖浸提工艺的研究方法主要集中在热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法等方面。其中酸浸提法和碱浸提法易导致多糖水解、分子糖苷键断裂、活性结构破坏、多糖得率降低；热水浸提法是一种经典工艺，提取方法简捷环保、成本低廉，多糖活性较高，但浸提次数多、收率低、周期较长[5-7]。新兴工艺技术主要涉及到酶法、超微粉碎法、超声波辅助法以及微波辅助浸提法等工艺技术[4-9]。但酶法生产成本相对较高，反应条件相对苛刻；超微粉碎法耗能相对较高；微波辅助法周期短，但植物细胞组织破碎剧烈，体系反应温度无法控制，易导致多糖分子裂解；而超声技术可产生空化效应、热效应、机械效应以及化学效应等超声协同效应，促进化学反应，加快溶质扩散溶解渗透，具有简便快捷、能耗低、效率高、时间短、提取率高、多糖活性较高等优点，在植物活性成分提取方面已得到广泛的应用[10-11]。

因此，实验以黑龙江省特色脱脂黑木耳微细粉为原料，通过超声波辅助热水浸提工艺技术，采用3 因素3 水平中心组合试验设计及响应面分析法，优化制备了高得率黑木耳多糖，得出了超声波辅助热水浸提工艺效果的非线性回归模型，旨在为黑木耳多糖新的生产工艺及产业化应用提供理论依据和实际参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验原料和试剂

黑木耳：市售，产于黑龙江省伊春市，购于2012年9 月28 日。

葡萄糖、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、苯酚、浓硫酸均为分析纯 天津市大茂化学试剂厂生产。

1.1.2 实验仪器

FW100 型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；JD1003B-3B 型电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司；DGG-9070A 型电热鼓风干燥机 上海森信实验仪器有限公司；TDL80- 2B 型离心机 上海安亭科学仪器厂；SHZW2C 型循环水式多用真空泵 河南巩义市英峪仪器厂；RE-52A 型旋转蒸发器 上海精密科学仪器有限公司；2102PCS 型紫外-可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公司；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；冷冻真空干燥器 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑木耳多糖提取工艺

参考多糖提取相关文献[4]，并进行适当修改。将黑木耳子实体依次清理去杂、55 ℃烘干、高速微细粉碎、脱脂等处理后，过150 目筛，制成黑木耳微细干粉。准确称取一定量的黑木耳细干粉，按照料液比为1∶36 比例加入一定量的蒸馏水，置于超声波反应槽中，调整超声波功率、超声提取时间和反应槽水浴温度进行超声提取。反应结束后取出真空抽滤，滤渣用热蒸馏水洗涤2 次，合并滤液。然后采用4 000 r·min-1离心分离10 min，取上清液测定多糖含量。合并上清液，减压浓缩至1/4 体积，加入95%浓度乙醇，低温（4 ℃）静置过夜。然后将醇沉液离心分离（4 000 r·min-1，10 min），去上清液，沉淀中加50 mL 蒸馏水使其重新溶解，按1∶1 加入sevag 试剂[12]脱蛋白，然后在5 000 r·min-1下离心5 min，将上清液减压浓缩至1/2体积后，冷冻干燥，制得黑木耳粗多糖。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的的绘制

参考相关文献[4，13]葡萄糖标准曲线的制备方法。将葡萄糖配成不同浓度的标准溶液，在490 nm 波长下用分光光度计测定其吸光值，并绘出浓度-吸光值标准曲线图，得出葡萄糖含量（x）与吸光值（y）的关系式为：y=0.015 4x +0.002 4，方程拟合度R2= 0.999 4，n=7，线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

1.2.3 黑木耳多糖含量的测定[14]

采用苯酚-硫酸法测定黑木耳多糖的含量。

1.2.4 黑木耳多糖提取率的测定

多糖提取率（%）= 多糖质量/子实体干重×100%。

1.2.5 中心组合试验设计与响应面分析

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理[15]，固定料液比为1∶36，自然体系pH 条件下，选取浸提时间（Z1）、浸提温度（Z2）以及超声波功率（Z3）三个因素作为试验因素，以黑木耳多糖提取率作为超声波辅助强化黑木耳多糖热水浸提效果的响应值，进行三因素三水平的响应面分析试验。确定三因素水平上限和下限，并对每一个因素的水平编码，得到编码表1，试验方案及结果见表2。数据处理采用SAS8.2 统计软件分析。

表1 中心组合试验因素水平编码表Table 1 Code of factors and levels

2 结果与分析

2.1 黑木耳多糖提取的结果分析

采用Box-Benhnken 的中心组合试验设计，试验结果如表2 所示。

表2 中心组合试验方案及结果Table 2 Results of experiments

以黑木耳多糖提取率为Y 值，得出浸提温度、浸提时间以及超声波功率的编码值为自变量的三元二次回归方程为：

Y =14.976 7 +0.13X1+1.327 5X2+0.252 5X3-0.755 8X12+0.33X1X2-1.301X22+0.45X1X3-0.18X3X2-0.560 8X32

对表2 数据进行方差分析，结果如表3 所示：

表3 F 检验方差分析表Table 3 Results of F-test variance analysis

对回归方程失拟性检验：F2＝3.49＜F0.05（3，2）＝19.16，差异不显著。对回归方程显著性检验：F1＝89.77＞F0.01（9，5）＝10.16，差异极显著。相关系数R2=S回/S总=0.993 8。由以上计算可知：该方程的显著性水平为0.01，回归方程与实际情况拟合较好。将中心处理公式及各因素编码公式代入，得到欲求的回归方程为：

从回归方程各项方差检验可看出，方程的一次项、二次项和交互项的影响均达极显著水平（p<0.01）。各因素对取代度影响的重要性依次为浸提温度＞浸提时间＞超声波功率。

2.2 交互效应及响应面分析

固定其中一个因素为0 水平（即编码水平为xi=xj=0），通过降维分析，得到另外两个因素对黑木耳多糖提取率的影响关系。以图2 为例，令X2=0，得到浸提时间和超声波功率交互效应方程为：

采用相同的方法，可建立黑木耳多糖提取率与其他任意两个因素间的交互效应关系，其结果如图2 所示：

图2 浸提时间与超声波功率对取代度影响的响应面图与等高线图Fig. 2 Response surface graph and contour map of extraction time and ultrasound power on extraction yield

由图2 可知，当浸提时间处于编码范围值（-1，0.17），超声波功率的编码范围值（-1，0.29）时，两者存在显著增效作用。当浸提时间在编码值为0.17，超声波功率在编码值为0.29 时，两者协同作用达到最佳。当提取温度处于编码范围值（0.17，1），反应时间的编码范围值（0.29，1）时，两者对黑木耳多糖提取率有明显的拮抗作用。

通过等高线的形状可反映出两者间交互效应的强弱关系。等高线表明在同一椭圆性的区域里面，多糖提取率相同。在图形中间的椭圆型区域里面，黑木耳多糖提取率最高；黑木耳多糖提取率由中心向两边逐渐降低。这主要是由于当浸提温度一定时，随着超声波功率的增加以及浸提时间的延长，高频声波可产生一系列空化效应、热效应、机械效应以及化学效应等超声协同效应，加大体系物料运动速度，加剧界面分子间碰撞机率，促进植物细胞壁破裂，加速目标有效成分扩散、溶解和释放，生产周期缩短，浸提率提高[4]。但若体系长时间处于高频电磁波辐照条件下，过高声强易导致体系无用气泡增加，散射衰减和非线性衰减程度上升，破壁作用减弱。同时超声效益引起的过强机械搅拌剪切作用，可导致多糖大分子结构破坏分子糖苷键断裂[5，9-10]，非糖杂质溶出，提取液色深粘稠，产物生物活性大大减弱，体系多糖浸出率反而大大降低。

2.3 提取工艺参数的优化与验证

采用3 因素2 次旋转回归设计，SAS8.2 统计分析软件分析，试验结果见表4：

表4 提取工艺参数优化值及验证结果Table 4 Result and optimal value of extraction technological parameter

由表4 可见：黑木耳多糖提取的最佳工艺条件为浸提时间21.4 min，浸提温度75.3 ℃，超声波功率325 W，黑木耳多糖理论提取率最大为15.38%，实测取代度最大值为15.28%，实测均值与理论预测值误差率为0.8%＜1%，说明回归模型拟和性较好。

2.4 不同实验结果比较分析

将本实验结果数据与相关文献实验报道数据对比，结果如表5 可见：

表5 黑木耳多糖提取工艺方法实验结果对比表Table 5 Comparison on extraction technology of auricular polysaccharide

由表5 可见，采用超声波辅助热水浸提黑木耳多糖工艺方法，其多糖提取率（15.28%）高于传统水提醇沉工艺方法（5.12%～14.06%），与超微粉碎技术结合酸法工艺多糖提取率相当（15.78%），略低于先超声处理后沸水浴长时浸提法以及超微粉碎技术结合超声波协同纤维素酶提取工艺多糖提取率（16.59%和16.98%），但考虑到提取工艺周期、生态保护、能耗、生产成本、产品活性以及工艺繁简等因素，本实验方法具有破碎效果好、提取生产周期短、不破坏分子结构、无环境污染、成本低廉、高效、工艺简捷以及有利于大规模化工业生产等优点而更具优势。

3 结论

3.1 超声波辅助热水浸提黑木耳多糖工艺过程中，各因素对黑木耳多糖提取率影响的重要性依次为浸提温度＞浸提时间＞超声波功率。

3.2 采用Box-Benhnken 的中心组合试验设计及响应面分析法，超声波辅助热水浸提黑木耳多糖的最佳提取工艺条件为浸提时间21.4 min，浸提温度75.3 ℃，超声波功率325 W，黑木耳多糖提取率最大值为15.28 %。

3.3 得出了浸提温度、浸提时间和超声波功率三因素对黑木耳多糖提取率影响的回归模型为：

Y=-65.555+0.500 3Z1+1.875 9Z2+0.030 6Z3-0.030 2Z12+0.006 6Z1Z2-0.013Z22+0.000 9Z1Z3-0.000 2Z3Z2-0.000 1Z32

［1］ 于开源，鞠晓峰，宫春颖. 微波辅助提取酸浆籽中多糖方法优化［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（5）：55-59.

［2］ Zhaocheng Ma，Jianguo Wang，Lina Zhang，et al.Evaluation of water soluble b-D-glucan from Auricularia auricularjudae as potential anti-tumor agent ［J］. Carbohydrate Polymers，2010，80：977-983.

［3］ Hua Zhang，Zhenyu Wang，Zhi Zhang，et al． Purified Auricularia auricular-judae polysaccharide （AAP I-a）prevents oxidative stress in an ageing mouse model［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84：638-648.

［4］ 王雪，王振宇.响应面法优化超声波辅助提取黑木耳多糖的工艺研究［J］.中国林副特产，2009，100（3）：1-4.

［5］ 曾维才，张曾，贾利蓉. 响应面法优化微波辅助提取黑木耳多糖工艺的研究［J］. 食品与发酵科技，2011，47（5）：45-48.

［6］ 王金凤.木耳多糖提取工艺研究［J］.食品科学，2004，25（6）：143-146.

［7］ 刘大纹，李铁柱，孙永海. 黑木耳多糖提取工艺的优化［J］.农业机械学报，2007，38（5）：100-103.

［8］ 杨春瑜，薛海晶. 超微粉碎对黑木耳多糖提取率的影响［J］.食品研究与开发，2007，28（7）：34-38.

［9］ 徐秀卉，杨波. 超声波法提取黑木耳多糖的工艺［J］.药学与临床研究，2011，19（2）：189-190.

［10］ 唐娟，马永强.超声波技术在黑木耳多糖提取中的应用［J］.食品与机械，2005，21（1）：28-29.

［11］ 闪俊杰，杜振雷，李青，等.超声波在化学工业中的应用［J］.河北工业科技，2009，26（3）：127-130.

［12］ 齐慧玲，魏绍云，王继伦，等. Sevag 法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000（3）：20-21.

［13］ 张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］. 2 版.杭州：浙江大学出版社，1998.

［14］ S.Suzanne Nielsen.食品分析［M］.北京：中国工业出版，2002.

［15］ BOX G E P，HUNTER W G. Statistics for experiments：an introduction to design，data analysis and model building［M］.New York：Wiley，1990.

［16］ 陆雯，蔡振优，鲜乔，等. 黑木耳多糖提取工艺条件的研究［J］.中国食品添加剂，2010，99（4）：99-102.