自然发酵东北酸菜中植物乳杆菌的分离与鉴定

王欣，李卯生

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

酸菜在我国历史悠久，早在1400 多年前《齐民要术》一书中就有记载酸菜的加工方法。我国东北和华北各地，由于冬季时间长，鲜菜不宜贮藏，广泛采用这种方法制作酸菜，可贮藏半年左右[1]。酸菜是经过乳酸发酵而制成的一种盐渍菜，最初是以保藏大白菜为目的，其腌渍液含盐量较低，在腌渍过程中借助于天然附着在蔬菜表面的微生物进行乳酸发酵，使成品具有酸、甜、香等独特风味而深受人们喜爱，得以在中国尤其在北方民间广泛发展，成为冬季主要蔬菜来源之一。

我国传统的腌渍酸菜大多数采用自然接种发酵工艺，生产周期长，产品质量不稳定，风味各异。它是利用蔬菜表面的附着微生物自然发酵，由于蔬菜表面微生物十分复杂，它们对发酵过程中以及酸菜制品的风味、品质都具有影响[2-3]。在发酵初期，好氧菌和酵母是占优势的微生物，乳酸菌的数量较少[4]。如果腌制过程未能做到严格的厌氧，则假丝酵母、红色圆球酵母就会大量繁殖，消耗乳酸而降低酸菜中乳酸含量，严重影响产品质量[5]。试验从酸菜发酵液中分离到一个菌株，经鉴定为植物乳杆菌，现将结果报告如下：

1 材料

1.1 酸菜

黑龙江省北安市某酸菜生产厂，生产批号20121025。

1.2 培养基及主要试剂

乳酸菌分离固体培养基，MRS 培养基，SL 培养基，PY 基础培养基，HP 培养基，YG 琼脂培养基等购于北京鼎国生物技术有限公司；葡萄糖、乳酸石碳酸棉兰染液、DNA 提取缓冲液、溶菌酶、T 载体、SDS、氯仿、异戊醇、异丙醇、去离子水、纤维素酶、70%冰乙醇、AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒、Taq DNA Polymerase、dNTP EDTA、BufferW1、BufferW2 Eluent、Buffer DE-A、Buffer DE-B 购于大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物

乳酸菌16SrRNA 基因扩增引物上游引物序列为5′-ACAGCTGCTGGTGCTGGC AATG-3′，下游引物序列为5′-TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 方法

2.1 乳酸菌菌落的分离纯化

取味道纯正的自然发酵酸菜汁为分离样，10 倍倍比稀释后涂布在平板上，并在27～28 ℃培养箱中培养48 h。挑取周围有透明圈的单个菌落，进行纯培养，挑取单个菌落进行革兰氏染色，在显微镜下镜检。

2.2 乳酸菌个体的生理生化鉴定

对分离株分别进行H2O2酶试验、硝酸盐还原、产硫化氢试验、精氨酸试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、葡萄糖产酸产气试验、木糖试验、鼠李糖麦芽糖试验、蔗糖试验、乳糖试验、山梨糖试验、菊糖试验、纤维二糖试验和甘露糖试验等。

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 DNA 的提取

按试剂盒说明书进行操作。

2.3.2 PCR 扩增

以分离菌株提取的基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增，反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火50 s，70 ℃延伸50 s，72 ℃末端延伸10 min。扩增结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳。

2.3.3 PCR 目的片段回收

按照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书操作。

2.3.4 PCR 目的片段的测序及序列分析

将回收的PCR 扩增产物连接T 载体送到上海生物工程技术服务有限公司测序，将测序结果输入GenBank 数据库，利用Blast 软件，与数据库中已测出的基因序列进行序列比对。

2.3.5 系统进化分析

采用最大节约方法考察数据组中序列的多重比对结果，优化出的进化树能够利用最少的离散步骤去解释多重比对中的碱基差异。实验通过综合使用clustalx1.83、BioEdit7.0、Mega 4.1 三种软件对分离菌株进行系统进化分析，描绘分离株与其他菌株的亲缘关系。

3 结果

3.1 分离菌株的形态学检测结果

分离菌株呈杆状，以长性、细长型、弯曲形和短粗状等多形态存在，细菌以单个、成对、短链状、呈簇及分散状等方式排列，如图1。MRS 固体培养基上，分离菌株主要呈边缘整齐、表面光滑、中央有凸起或扁平的白色菌落，或者边缘不整齐、表面粗糙无光泽和中央有凸起或扁平的褐色或乳黄色菌落，在菌落的周围可看到光亮的菌圈，该分离株命名为helsc。

图1 分离株helsc 的染色镜检结果Fig.1 Result of staining and microscopic examination

3.2 分离株helsc 的PCR 检测结果

分离株helsc 的PCR 检测结果，通过PCR 扩增获得1 200 bp 左右的目的片段，结果如图2。

图2 分离株helsc16SrRNA 基因的PCR 扩增产物Fig.2 PCR amplification of 16SrRNA gene

3.3 分离株helsc 的序列分析和系统进化分析结果

分离株16SrRNA 基因序列与GenBank/EMBL/DDBJ 数据库中序列Blast 结果显示，与乳酸杆菌的同源性超过97%，故可确定其为乳酸杆菌属。利用Mega4.0 做系统进化树，比较相关菌株序列之间的亲缘关系，从图3 中可知，helsc 和Lactobacillus plantarum strain H2（Lactoba15）在系统位置上最近，亲缘关系较近，分离株序列和Lactobacillus plantarum strain H2 的同源性达到97%，从而确定该分离株为植物乳杆菌。

4 讨论

酸菜是一种传统的发酵蔬菜制品，主要由乳酸菌发酵而制成。近年来随着人们对乳酸菌及乳酸生物功能和保健功能认识的提高，酸菜也被越来越多的人们所喜爱。酸菜中富含维生素A、B、C 等重要的维生素和多种矿物质，是一种既安全又营养的蔬菜发酵制品[7]。酸菜发酵是乳酸杆菌分解白菜中糖类产生一种能够直接被人体所吸收的有机酸——乳酸的结果。乳酸被人体吸收后可刺激消化腺分泌消化液帮助消化增进食欲，能抑制大肠内腐败菌类的繁殖减少毒素的产生，并吞噬致癌物质，能有效的防止结肠癌、直肠癌等。

图3 Helsc 菌株系统进化树Fig.3 Result of helsc evolution tree

试验以自然发酵的东北酸菜为对象，进行了乳酸菌的分离鉴定。采用形态学、生理生化特性和分子生物学方法相结合，在分离株为乳酸菌的基础上，从基因水平上进行鉴定分类，着重进行了16SrRNA 序列同源性分析，构建系统进化树，从而确定其为植物乳杆菌。

现代微生物学的发展，揭示了乳酸菌对人体健康有益作用的机理，也使得具有营养保健作用的乳酸菌发酵食品更加受到消费者的喜爱。乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品的风味，提高食品的价值和保藏性[8]，而且，近年来，乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视，尤其是近年来在降低胆固醇作用方面进行了初步的研究[9-10]。试验对自然发酵的酸菜进行乳酸菌的分离鉴定，接下来要对该菌的特性和功能进行系统的研究，为将来从事酸菜的纯菌发酵和工厂化生产奠定理论基础。

［1］ 尼海峰，邓冕，冯月玲. 东北酸菜产业现状与发展对策［J］. 中国调味品，2011，36（6）：10-12.

［2］ 闫肃，吕嘉枥，郜洪涛. 乳酸菌在食品工业中的应用［J］.中国酿造，2010，225：1-3.

［3］ 金世琳. 乳酸菌的科学与技术［J］. 中国乳品工业，1998，26（2）：14-16.

［4］ 乌日娜. 内蒙古传统发酵酸马奶中乳杆菌的分离鉴定及16RsRNA 序列同源性分析［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2005.

［5］ 杨万名. 细菌分子遗传学分类鉴定法［M］. 上海：上海科学技术出版社，1990.

［6］ 崔敬爱. 酸菜优良发酵菌种的筛选及应用研究［D］. 长春：吉林农业大学，2005.

［7］ 赵文红，黄小丹，范敏华. 自然发酵泡菜中乳酸菌的分离及特性研究［J］. 广州食品工业科技，2003（1）：46-50.

［8］ 张燕，周常义，苏文金. 乳酸菌及其代谢产物在食品保鲜中的应用研究进展［J］. 农产品加工学刊，2012，277（4）：21-27.

［9］ 李常营，卢晓霆，于志会，等.酸菜来源植物乳杆菌S4-5的降胆固醇作用［J］. 食品科学，2011，3（7）：69-72.

［10］ 于志会，李常营.酸菜中降胆固醇功能植物乳杆菌的体外筛选［J］. 食品与生物技术学报，2011，30（3）：398-402.