配位体交换色谱法分析果葡糖浆中的单糖

贾鹏禹，孙蕊，何冬亮，黄学英

（1. 黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，大庆 163319；2. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院;3. 苏州赛分科技有限公司）

果葡糖浆也称高果糖浆或异构糖浆，是以酶法糖化淀粉所得的糖化液经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖组成的混合糖糖浆，其应用领域十分广泛[1]。F42果葡糖浆（一代，果糖含量42%）中的葡萄糖含量较高，果糖含量较低，不足以满足医疗和保健的需要，并且低温时易结晶，不便贮存。因此提高果葡糖浆中果糖含量，生产F55果葡糖浆（二代，果糖含量55%）和F90果葡糖浆（三代，果糖含量90%）是产业发展的技术需求[2]。未来几年，模拟移动色谱技术（SMB）将成为推动此项技术进步的主要动力[3-5]。

一般性样品中单糖的高效液相色谱分析方法多采用正相色谱柱的反相洗脱模式（氨基柱-乙腈/水）[6]，此方法乙腈消耗极大、非环境友好方法；也可采用柱前衍生化反相液相色谱法，但处理较复杂，多适用于复杂基体中单糖检测[7-8]。配位体交换色谱法（ligand exchange chromatography）即依靠含有金属离子配体的离子交换树脂对糖组分交换势的差异，从而得到分离，样品无需衍生化处理，大多可直接上样，稳定性优越。

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：1200 美国Agilent 公司），配备：G1310A 四元梯度泵、G1362A 示差折光检测器、G1329A 恒温自动进样器、G1322A 在线脱气机、G1316A 柱温控制单元、chemstation 色谱工作站；电子分析天平（型号：ML104 瑞士梅特勒公司）；pH计；手持式电导率仪。

1.2 试剂、实验材料

果糖、葡萄糖（分析纯）。实验所用乙腈为色谱纯、水为超纯水，其他试剂均为国产色谱纯或分析纯试剂；果葡糖浆（F42）由黑龙江昊天科技有限公司提供，F55和F90由F42经八一农垦大学农产品检测中心实验室SMB 装置纯化制得。

1.3 样品前处理与标准工作曲线绘制

取果葡糖浆样品2 mL 用纯水稀释后定容至100 mL，上机样经0.45 μm 的滤膜过滤进行HPLC分析。

精密称取葡萄糖、果糖标准品用水定容至100 mL 溶液，各配制成5、25、50、75、100 mg·mL-1系列混合标准溶液。标准溶液经0.45 μm 的滤膜过滤进行HPLC 分析，以各浓度对应峰面积做回归方程。保留时间定性，外标法、面积归一化法定量。

1.4 HPLC 条件

色 谱 柱：Sepax Carbomix Pb -NP10 （300 ×7.8 mmID，10 μm，8%交联度，PN：241008-7830），配同系保护 柱Carbomix Pb-NP10 （50×7.8 mmID，10 μm，8%交联度，PN：241008-7805）；流动相：纯水；流速：0.6 mL·min-1；柱温：80 ℃；示差检测器温度：30 ℃，响应时间：6 s；进样量：5 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法适应性与糖配位体交换色谱分离机制

由图可见，图1（a）标准样品色谱图中葡萄糖和果糖分别在15 min 和22 min 处洗脱；图1（b）中F42样品全部组分分离在30 min 内完成，目标峰位无干扰。

图1 葡萄糖和果糖标样色谱图Fig.1 Sample chromatograms of Glucose and fructose

配位体交换色谱法所用分析柱填料多采用基于配体交换作用的聚合物树脂，如图2 所示，配体交换树脂是高度磺化的阴离子交换树脂，带有1，2 族或过渡金属元素，树脂上的磺酸基团通过离子吸引力将金属离子紧紧吸附于柱上而不会被洗脱。单糖的配体交换分离机制：糖分子（如葡萄糖）上每一个羟基都带有一个非常弱的负电荷，而端基异构碳上所带的羟基可被去质子化，从而带上一个很强的负电荷，糖分子上的这些负电荷与树脂表面上的金属离子的正电荷之间的相互作用使糖被保留，由保留的差异从而达到分离。

2.2 色谱柱的选择

配位交换分配形式的固定相是4%～10%交联的聚苯乙烯磺酸盐，通常用纯水作流动相。配位体交换色谱柱分离的选择性要通过选择树脂类型、树脂上络合金属元素类型（抗衡离子）、柱温和流动相等条件来控制，一般状况下，针对不同组分选择合适的抗衡离子是决定分离的关键。实验考察了抗衡离子为钙离子（Ca2+）和铅离子（Pb2+）两种填料对果葡糖浆中单糖分离的影响，发现铅（Pb2+）柱对分离多种单糖更具优势，具有较好的分离度，因此实验采用铅（Pb2+）柱分离；另外考虑到分离柱运行压力的耐受性，实验选择了刚性更强的高交联度树脂，交联度为8%。

图2 色谱柱填料与配体交换的分离机制Fig.2 Separation mechanism of M-PS/DVB HPLC packing and ligand exchange

2.3 色谱分离的改善与优化

配位体交换在进行糖混合物分离时，水（流动相）与柱上金属离子间也存在非常弱的离子吸引力，用水作为流动相来竞争洗脱被吸附住的糖，这样的吸附解附贯穿于整个分离过程[9]。如图2 所示，在洗脱过程中糖与流动相共同争夺吸附在树脂上的金属离子，由于各种糖与金属离子形成络合物能力的不同，即产生了分离。基于流动相对组分洗脱能力的可调性，故在流动相中加入10%～20%的乙腈即可分离。另外，实验发现加入少量乙腈（V水/V乙腈=95∶5）的流动相可大大抑制溶剂系统中菌的产生，保证色谱柱的使用寿命，延长保存时间，而不必购买剧毒叠氮化钠抑菌剂。

常温条件下配位交换分离结构类似的糖，其分辨率和柱效并不好，所以这种分离形式常在较高温度（一般80 ℃）下进行，温度提高降低了流动相的粘度，使得运行压力较低，对于刚性较差的聚合物基质的色谱柱有利；另外柱温提高可以避免糖发生旋光现象[10]。

2.4 样品前处理

配体交换分离的色谱柱内抗衡离子是色谱分离的关键，抗衡离子的流失和改变会严重影响柱效，因此在采用配体交换分离之前要严格考察样品，如样品来源、电导率、样品pH 值、有机溶剂含量、含醇量及重金属离子等。实验对上述参数进行了测试，可作为配体交换色谱样品前处理中样品考察的一般流程，见表1。

表1 样品评估流程Table 1 The process of sample investigation

2.5 方法精密度、标准曲线与检测限

实验考察了方法精密度，取混标样品连续进样6次，考察各组分峰面积的相对标准偏差，葡萄糖和果糖的精密度（RSD，n=6）分别为：0.63%和0.76%；对两种单糖进行线性范围考察；根据峰面积A 对单糖浓度C（mg·L-1）进行线性回归，依据三倍噪声计算检测限。结果见表2。

表2 线性回归方程Table 2 Linear regression equations

2.6 回收率实验

实验采用实际样品中定量加入混标的方式进行了回收率实验，采用外标法定量，测得单糖平均回收率在98.3%～102.6%之间，相对标准偏差（RSD）为0.41%～0.83%。

2.7 样品测试结果

实验采用归一化定量方法对6 个不同批次的F42、F55、F90型果葡糖浆中葡萄糖和果糖含量进行了检测。不同批次所得各单糖平均值（ω/ω）见表3。

表3 样品测定结果Table 3 Test results of samples

3 小结

通过配位体交换示差折光检测器高效液相色谱实现了果葡糖浆中的葡萄糖和果糖含量的测定，方法简便普适，重现性好，测试成本低廉；此法可为果葡糖浆（F42、F55、F90）生产工艺的控制提供准确的数据。但此法受示差检测器灵敏度的局限性制约，采用灵敏度更高的蒸发光散射作为检测器配置将使得整体解决方案更为出色。

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