格氏乳球菌素LG34 生物稳定性的研究

刘姗，高玉荣

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的肽或前体，通常认为它只作用于与产生菌同种的其他菌株或与其亲缘关系很近的物种[1]。鉴于乳酸菌产生的细菌素具备高效、体内无残留、无抗药性及不污染环境等特点，近年来被推荐作为生物型的防腐剂用于食品的保藏当中[2]。目前只有Nisin[3]和pediocin PA-1/AcH 在工业中有应用，但由于这些细菌素只对大多数革兰氏阳性细菌有抑制作用，但对革兰氏阴性细菌无作用，而且在酸性环境下不稳定，这使得目前乳酸菌细菌素的应用范围较窄，限制了其在食品中的应用[4]。因此开发新型广谱、抗菌活性强，稳定性强的乳酸菌细菌素已成为目前的发展趋势。在前期实验中已从发酵酸黄瓜中筛选出了一株产新型广谱细菌素的Lactococcus garvieae LG34，并对其产生的格氏乳球菌素LG34 进行了分离纯化。对其抑菌谱及温度、酶、酸碱、无机盐、有机溶剂、表面活性剂对其生物稳定性的影响进行了研究，为其在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

Lactococcus garvieae LG34：从发酵酸黄瓜中筛选得到一株产广谱细菌素的乳酸菌。

抑菌谱所用菌（见表1）：黑龙江八一农垦大学微生物实验室保藏菌种。

1.2 培养基

MRS 培养基（g·L-1）：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO4·3H22 g，乙酸钠5 g，CaCO35 g，柠檬酸三铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐温-80 1 mL，pH 6.5。

营养肉汤培养基（g·L-1）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，pH7.2～7.4。

指示菌上层培养基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨8 g，琼脂0.8 g，pH 值为7.4～7.6。

指示菌下层培养基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨8 g，琼脂1.5 g，pH 值为7.4～7.6。

1.3 细菌素样品的制备

将保存在MRS 斜面培养基的Lactococcus garvieae LG34 挑取1～2 环转接到10 mL MRS 液体培养基中，于30 ℃静置培养16～18 h，按2%～3%扩大培养24 h。将发酵液在4 000 r·min-1下离心20 min，将无细胞上清液调pH 至6.0，旋转蒸发浓缩10 倍。加入4 倍体积预冷至-20 ℃无水乙醇过夜沉淀，再将浓缩液旋转蒸发浓缩2 倍。

1.4 格氏乳球菌素LG34 抗菌谱测定

分别选取G+、G-、霉菌、酵母菌为指示菌，采用琼脂扩散法测定格氏乳球菌素的抑菌效果。

1.5 温度、蛋白酶及pH 对格氏乳球菌素LG34 的影响

将格氏乳球菌素LG34 在80、90、100 ℃分别处理30 min 和60 min，121 ℃处理30 min 后，以未经热处理的作为对照，测定热处理后的格氏乳球菌素LG34 对金黄葡萄球菌的抑菌活性。

将胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别溶解在20 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH 7.6、pH 2.0、pH 6.2、pH 7.0、pH 7.0）中配成酶母液，分别加入格氏乳球菌素LG34 提取液，使酶终浓度为5 mg·mL-1，在37 ℃水浴中温浴5 h，取出后将pH 调到6.0，以金黄色葡萄球菌为指示菌，用琼脂扩散法检测抑菌活性，以未加酶处理的样品作为对照，检测各种蛋白酶对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响。

将格氏乳球菌素LG34 样品的pH 值用1 mol·L-1NaOH 和1 mol·L-1HCl 分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，经12 h 作用后将pH 值调至6.0，以未处理的细菌素样品为空白对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定pH 对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响。

1.6 无机盐、有机溶剂及表面活性剂对格氏乳球菌素LG34 的影响

分别将0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol·L-1的NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，摇匀后静置4 h，采用琼脂扩散法测定无机盐对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响。

将10%、20%、30%、40%、50%体积的氯仿、丙酮、乙醚、甲苯、异丙酮加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，摇匀后静置4 h，测定有机溶剂对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响。

分别将10%、20%、30%、40%、50%体积的甘油、吐温-80 加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，摇匀后静置4 h，测定表面活性剂对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响。

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 细菌素抑菌谱的测定

由表1 可见，格氏乳球菌LG34 的抑菌谱较广，除枯草芽孢杆菌外，对大多数革兰氏阳性菌均有抑制作用，而且对革兰氏阴性菌也有抑制作用，但不抑制霉菌和酵母菌。

2.2 温度对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响

由图1 可以看出，格氏乳球菌素LG34 对热很稳定，在经121 ℃处理30 min 后抑菌活性仅降低了10.5%。敖灵[5]研究的戊糖乳杆菌C50-6 菌株产细菌素和单春乔等[6]研究的嗜酸乳杆菌产细菌素对热很稳定，在121 ℃处理20 min 后仍能保持80%以上的活性。因此在食品生产与加工业进行杀菌处理的过程中，不会导致细菌素抑菌活性的丧失。

表1 Garviecin LG34 的抑菌谱Table 1 Antimicrobial spectrum of garviecin LG34

图1 温度对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Fig.1 Effect of temperature on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

2.3 蛋白酶对格氏乳球菌素LG34 活性的影响

表2 蛋白酶对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Table 2 Effect of enzymes to antimicrobial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表2 可以看出，格氏乳球菌素LG34 经胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶处理后抑菌作用减弱，但并没有消失，其中经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的抑菌活性损失率分别为61.3%和62.9%，说明格氏乳球菌素LG34 对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强敏感性，而对其他三种酶具有弱的敏感性。由于细菌素是一种蛋白类物质，当细菌素作为生物防腐剂随食物进入人体消化道时可被蛋白酶降解而不会在体内残留，具有较高的安全性。

2.4 pH 对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响

除此之外，还针对河道的化学需氧量、氨氮量以及总氮量等指标进行了检测，结果显示各项指标均明显优于河道治理工作开展前，说明生物生态修复治理工作在水系水体环境的治理工作中发挥出了较好的应用效果，为提高普陀区桃浦镇北环水系水体治理水平产生了积极影响。

图2 pH 对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Fig.2 Effect of pH on the antibacterial activity for Lactococcus garvieae LG34

由图2 表明，格氏乳球菌素LG34 的抗菌活性在pH 2.0～8.0 具有较好的稳定性，在pH 2.0 处理后活性仅损失18%，说明格氏乳球菌素LG34 具有较好的耐酸能力；在中性条件下格氏乳球菌素LG34 抑菌效果最好，但当pH 大于9.0 后抑菌活性损失较大，在pH 值11.0 时抑菌活性最弱。国内，李琳等[7]研究的细菌素ST9 和陈静等[8]研究的嗜酸乳杆菌产细菌素，国外Jamuna M 等[9]研究的乳酸片球菌素和Todorov等[10]研究的类细菌素，在酸性至中性条件下都具有较好的稳定性。

2.5 无机盐对细菌素抑菌活性的影响

图3 无机盐对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Fig.3 Effect of inorganic salt on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由图3 可以看出，无机盐对格氏乳球菌素LG34抑菌活性的影响显著，抑菌活性的损失随着无机盐浓度的提高而增大。这5 种无机盐对格氏乳球菌素LG34 的影响大小依次为：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4。韩诚武[11]对副干酪乳杆菌素的研究表明Na+、K+一价金属离子对副干酪乳杆菌素活性的影响较小，而Mg2+、Ca2+二价金属离子降低了副干酪乳杆菌素的活性。

2.6 有机溶剂对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响

由表3 可见，添加10%～50%的有机溶剂对抑菌活性的影响不显著。通过单因素方差分析所得的P值在0.05 水平上影响差异不显著。在李亚玲[12]的乳酸片球菌细菌素分离纯化及理化性质研究文章中结果表明有机溶剂对细菌素抑菌活性影响不显著，与结果基本一致。

2.7 表面活性剂对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响

表3 有机溶剂加量对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Table 3 Effect of the amount of organic solvent to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

表4 表面活性剂吐温80 和甘油对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响Table 4 Effect of surfactant Tween 80 and glycerol to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表4 可见，添加表面活性剂吐温80、甘油后对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影响不显著。

3 结论

3.1 试验验证了格氏乳球菌LG34 的抑菌谱较广，既能抑制革兰氏阳性菌，也能抑制革兰氏阴性菌。

3.2 格氏乳球菌产细菌素LG34 具有较好的耐热特性，在80、90 和100 ℃分别处理30 min 和60 min后，抑菌活性损失不到10%，121 ℃处理30 min 后仅损失10.5%；格氏乳球菌素LG34 对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强敏感性，对中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶具有较弱的敏感性；格氏乳球菌素LG34具有较好的耐酸特性，pH 值在2.0～8.0 时均能保持稳定的抑菌活性，抑菌活性损失小于20%。

3.3 KCl、NaCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影响显著，影响大小依次为：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4；有机溶剂甲苯、丙酮、乙醚、石油醚、氯仿及表面活性剂甘油、吐温80 对格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影响不显著。

［1］ 苏芳，李莉，罗斌. 戊糖乳杆菌WH12-2-1 产细菌素条件的优化［J］. 中国乳品工业，2010，38（3）: 10-15.

［2］ 张子健，刘玉恩，赵谦. 植物乳杆菌C8-1 产类细菌素的初步研究［J］. 中国乳品工业，2010，38（1）: 15-22.

［3］ 周瑶，王颖，安宇. 奶酪中产杆菌样细菌素乳酸菌的分离与鉴定［J］. 黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（3）:60-63.

［4］ 李丽. 乳酸片球菌素抑菌机理研究［D］.天津:天津大学，2009.

［5］ 敖灵. 戊糖乳杆菌C50-6 细菌素的纯化和特性研究［D］.四川:四川农业大学，2008.

［6］ 单春乔，刘秋晨，林洋. 嗜酸乳杆菌产细菌素生物学特性的研究［J］. 微生物学杂志，2009，29(1): 90-93.

［7］ 李琳，贾士儒，等. 嗜热链球菌CGMCC 1.1864 所产的一种新型细菌素ST9［J］. 微生物学通报，2010，37（3）:349-354.

［8］ 陈静，何连芳，张玉苍. 嗜酸乳杆菌产细菌素的分离纯化研究［J］. 河南工业大学学报，2011，32（2）: 68-72.

［9］ Jamuna M， Jeevaratnam K. Isolation and partial characterization of bacteriocins from Pediococcus species［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2004，65（4）: 433-439.

［10］ Todorov S D，Dicks LMT. Screening for bacteriocinproducing lactic acid bacteria from boza，a traditional cereal beverage from Bulgaria Comparison of the bacteriocins［J］. Process Biochemistry，2006，41（1）: 11-19.

［11］ 韩诚武. 副干酪乳杆菌素抑菌活性及抑菌机理的研究［D］. 哈尔滨:黑龙江大学，2008.

［12］ 李亚玲. 乳酸片球菌细菌素的分离纯化及理化性质研究［D］. 天津:天津大学, 2007.