海藻酸钙固定化At. ferrooxidans 的研究

张爽，陈志宝，晏磊，马星辰，赵丹

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

At. ferrooxidans 是一种以Fe2+或低价态硫作为能源生长、革兰氏染色阴性、端生鞭毛具运动性的化能自养菌[1-2]。固定化At. ferrooxidans 在酸性矿坑废水和H2S 等废气的治理中具有广泛的应用[3]。由于游离At. ferrooxidans 在废气处理中存在损失量大、气体处理量小等缺点，目前主要开发固定化At. ferrooxidans用于H2S 的脱除和Fe2+的再生。因此，研究At. ferrooxidans 的固定化对于H2S 的处理工艺至关重要。海藻酸钠具有价格低廉，对细胞毒性相对较小，固定化容易成形，传质性能好，性质稳定，且对微生物细胞的富集程度高等优点，而成为目前应用最广的包埋剂之一[4]。

实验以At. ferrooxidans 为包埋对象，以海藻酸钠为包埋载体，CaCl2为交联剂，制备海藻酸钠固定化凝胶珠。考察了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、硝酸钙浓度及细胞数量对Fe2+氧化率的影响，并确定最佳固定化条件。

1 材料

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

At. ferrooxidans ATCC23270。

1.1.2 培养基

0 K 液体培养基[5]：（NH4）2SO43.0 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，蒸馏水1 000 mL，调pH 至1.8，121 ℃灭菌15 min。

9 K 液体培养基[5-6]：0 K 液体培养基内加入经过滤除菌的FeSO4·7H2O（调整pH 至1.8），使Fe2+终浓度为8.9 g·L-1。

1.1.3 主要试剂和仪器

海藻酸钠（化学纯，温州市东升化工试剂厂）；Ca（NO3）2（分析纯，沈阳市华东试剂厂）；CaCl2（分析纯，沈阳市华东试剂厂）。

PHSJ-3F 型实验室pH 计（上海雷磁仪器厂）；KD-S14 电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；HZQ-C 空气浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

将培养好的At. ferrooxidans，按10%接种量分别接种到5 份盛有9 K 培养基的三角瓶中，恒温30 ℃空气震荡培养48～72 h（150 rpm）。所得培养液1 500 rpm 离心5 min，弃去沉淀，上清液12 000 rpm离心15 min，收集细胞。去离子水溶解细胞，制得细胞悬液。

2.2 细胞固定化

将配制好的一定浓度的海藻酸钠40 mL 煮沸20 min，冷却至30 ℃。加入一定浓度的细胞悬液，充分搅拌，待菌株与海藻酸钠充分混合后，静置30 min。在10 cm 高处，用9 号针头将海藻酸钠和At. ferrooxidans 的混合液，逐滴匀速滴入到一定浓度的交联剂中，固定2 h，双层纱布过滤，弃液体。pH 2.0稀硫酸反复冲洗5 次，转至含新鲜配制的9 K 培养基中，恒温30 ℃空气震荡培养72 h（150 rpm），测定Fe2+氧化率。

2.3 细胞固定化影响因素分析

2.3.1 交联剂种类及浓度对细胞固定化的影响

交联剂选用Ca（NO3）2，设置2%、3%、4%、5%、6%五个浓度，按上述方法制备At. ferrooxidans 固定化细胞并测定其对Fe2+的氧化。交联剂选用CaCl2，设置2%、3%、4%、5%、6%5 个浓度，按上述方法制备At. ferrooxidans 固定化细胞并测定其对Fe2+的氧化。

2.3.2 海藻酸钠浓度对细胞固定化的影响

分别配制浓度为1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的海藻酸钠，按上述方法制备At. ferrooxidans 固定化细胞并测定其对Fe2+的氧化。

2.3.3 At. ferrooxidans 细胞浓度对细胞固定化的影响At. ferrooxidans 细胞浓度分别设置为3×108、6×108、9×108、1.2×109及1.5×109cell·mL-1，按上述方法制备At. ferrooxidans 固定化细胞并测定其对Fe2+的氧化。

2.4 Fe2+氧化率测定

Fe2+浓度的测定采用重铬酸钾滴定法[7]。

3 结果与讨论

3.1 交联剂种类及浓度

Ca（NO3）2和CaCl2是两种常用交联剂，为了探讨其对At.ferrooxidans 固定化效果，分别选取不同浓度的Ca（NO3）2和CaCl2作为交联剂，制成At. ferrooxidans固定化细胞，以其对Fe2+的氧化率作为检测指标，结果见图1。由图1 可知，随着交联剂浓度的增加，Fe2+的氧化率逐渐减小，实验中我们发现，以Ca（NO3）2为交联剂制成的凝胶珠坚硬，机械力强。CaCl2的浓度大于2%时，制成的凝胶珠过于紧实，使底物和产物的扩散相对困难。

相同浓度的CaCl2与Ca（NO3）2作交联剂时，制得的凝胶珠形状均较好，且机械力强，但以前者为交联剂制得的凝胶珠对Fe2+的氧化率远大于后者。因此，后续的实验中选用的交联剂为2%的CaCl2。

图1 不同浓度Ca（NO3）2 和CaCl2 对Fe2+氧化率的影响Fig.1 The effect of calcium nitrate and calcium chloride with different concentrates of oxidize rate for Fe2+

3.2 海藻酸钠浓度

选取CaCl2浓度为2%，细胞浓度为1×109，海藻酸钠浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%进行细胞固定化实验。通过海藻酸钠浓度的改变，观察其对Fe2+的氧化情况，结果见图2。由图2 可知，2.5%的海藻酸钠对Fe2+的氧化率最高。实验发现，当海藻酸钠浓度低于2%时，制得的凝胶珠形状不规则，且较松软，机械强度低，所包含的细胞数目较少；随着海藻酸钠浓度的升高，制得的凝胶珠形状成规则的圆球状，但随着海藻酸钠浓度的增加，使得溶液粘度增加，导致针头堵塞，凝胶珠形成困难。海藻酸钠的浓度为2.5%时，形成的凝胶珠大小均匀，对Fe2+的氧化效果较好。

图2 海藻酸钠浓度对Fe2+氧化率的影响Fig.2 The effect of sodium alginate concentrate of oxidize rate for Fe2+

3.3 At. ferrooxidanscells 细胞浓度

取浓度为2%的CaCl2，海藻酸钠浓度为2.5%，细胞 终 浓 度 分 别 为3×108、6×108、9×108、1.2×109、1.5×109，进行细胞固定化实验。通过调整细胞终浓度，研究其对Fe2+的氧化率的影响，结果见图3。由图可知，细胞浓度为1.2×109时，Fe2+的氧化效果最好。随着细胞浓度的增加，Fe2+的氧化率呈先升高后降低的趋势，其主要原因是海藻酸钠对细胞的包埋具有饱和性，当细胞浓度超过1.2×109时，海藻酸钠包埋的细胞制得的凝胶珠传质及传氧性变差。

4 结论

海藻酸钠- 氯化钙能较好的固定At. ferrooxidanscells 菌株，最佳固定化条件为：CaCl2浓 度 为 2% ， 海 藻 酸 钠 浓 度 为 2.5% ，At. ferrooxidanscells 细胞浓度为1.2×109cell·mL-1，对Fe2+的氧化率分别为99.83%、99.62%、99.42%。该方法制得的凝胶珠性质稳定，机械强度好，具有较好的工业应用前景。

图3 A.f 细胞数量对Fe2+氧化率的影响Fig.3 The effect of cell concentrate for the oxidize rate of Fe2+

［1］ Lei Yan， Huan -huan Yin， Shuang Zhang， et al.Organoarsenic resistance and bioremoval of Acidithiobacillus ferrooxidans ［J］. Bioresour Technol，2010，101（16）:6572-5657.

［2］ 李师翁，王玉建，涂玮，等. PVA-Ca（NO3）2法固定化氧化亚铁硫杆菌对Fe2+的氧化及动力学研究［J］.环境污染与防治，2007，29（1）:14-17.

［3］ 王玉建，李红玉. PVA-Ca（NO3）2法包埋固定氧化亚铁硫杆菌研究［J］.微生物学报，2006，46（3）:456-459.

［4］ 包木太，田艳敏，陈庆国. 海藻酸钠包埋固定化微生物处理含油废水研究［J］. 环境科学与技术，2012，35（2）:167-172.

［5］ Lei Yan，Huan -huan Yin，Shuang Zhang，et al.Biosorption of inorganic and organic arsenic from aqueous solution by Acidithiobacillus ferrooxidans BY-3 ［J］. J Hazard Mater，2010，178（1）: 209-217.

［6］ 晏磊，张爽，李雪，等. 氧化亚铁硫杆菌的磁性及铁源种类对磁小体合成的影响［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（1）:23-27.

［7］ 黄运显，孙维贞.常见元素化学分析方法［M］. 北京:化学工业出版社，2008.