黄鳝α-L-岩藻糖苷酶基因克隆及其在雌雄个体间的表达分析

王 道，廖高鹏，肖亚梅

(湖南师范大学生命科学学院，教育部蛋白质化学和鱼类发育生物学重点实验室，中国 长沙 410081)

岩藻多糖降解酶主要包括3种酶：岩藻多糖酶、α-L-岩藻糖苷酶和硫酸酯酶．α-L-岩藻糖苷酶是一种催化含岩藻糖基的糖蛋白、糖脂等生物活性大分子水解酶的溶酶体酸性水解酶，主要负责水解岩藻多糖糖苷键的非还原末端的L-岩藻糖残基，释放出岩藻糖[1]，广泛分布于人体和动物的组织细胞、血液和体液中[2-4]．FUCA1(α-L-岩藻糖苷酶-1)属于糖基水解酶29家族的一员．FUCA1作为一种同型四聚体，负责水解和减少在各种组织中的糖蛋白的部分碳水化合物．研究证实α-L-岩藻糖苷酶基因是小鼠性腺发育的相关基因，小鼠精子顶体中的N-乙酰基-葡萄糖胺苷酶，被证明参与精卵识别[5]．黄鳝(Monopterusalbus)，属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)，合鳃目(Synbranchiformes)，为温带淡水鱼类，拥有复杂的生殖发育过程．黄鳝从受精卵发育到首次性成熟时是雌性个体，随后逐渐地发育为雄性个体，中间的过渡时期为雌雄同体．黄鳝从雌到雄的转变过程被称为性逆转．黄鳝这种独特的天然生理现象使它成为研究鱼类性别控制机理的一种重要动物．本研究选用黄鳝(Monopterusalbus)为研究材料，研究FUCA1基因在鱼类不同生殖发育阶段中的分化表达模式，以进一步了解和发现岩藻糖苷酶基因在黄鳝性逆转调控中的作用，为探究鱼类的性别决定机制提供新线索．

1 材料与方法

1.1 试验材料

从湖南省长沙市水产批发市场购买实验用黄鳝．选取已经达到性成熟阶段的雌、雄黄鳝(雌雄各3尾)，用解剖刀断头放血后，迅速用镊子摘取黄鳝的雌、雄性腺组织，并且用液氮处理后，冻存于-80 ℃的冰箱中备用．

1.2 主要试剂

FUCA1特异引物由上海生物工程公司合成；总RNA提取试剂盒E.Z.N.A Total RNA KitⅡ购自Omega公司；反转录试剂盒RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit购自Fermentas 公司；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒购自Clontech公司；UniQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司；PCR Mix 购自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T载体购自Takara公司．

1.3 试验方法

1.3.1 黄鳝FUCA1基因cDNA克隆 首先从黄鳝卵巢组织中用RNA提取试剂盒得到总RNA，然后根据反转录试剂盒(RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit)做反转录反应以获取模板cDNA．根据NCBI的genebank中已经报道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4 )和鼠FUCA1(GenBank accession number: nm024243.4)共同的保守区，用软件Primer premier 5.0设计一对简并引物E-1和E-2(E-1：5′-TCGGGATTTGGTTGGTG-3′，E-2：5′-CTGGCAAGCTCTGTGGC-3′)．再以cDNA为模板，选用正负引物进行PCR扩增反应，PCR反应总体积为20 μL (灭菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL，正负引物各1 μL)．PCR反应条件：94 ℃预热 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35 个循环；72 ℃ 延伸10 min，最后4 ℃保存．用1.6%的琼脂糖凝胶进行电泳检测目的条带，用小刀迅速切下目的条带，回收纯化、克隆后送上海生工公司测序．

3′端RACE方法的扩增：根据已经获得的黄鳝FUCA1基因的中间片段设计特异引物F3OP和F3IP(F3OP：5′-AGTGCTGCTGGAACGGAAATGAC-3′，F3IP：5′-TGTTGGACCGCAGCCAGC-3′)．使用试剂盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit获取3′的cDNA，吸取1 μL作为模板，用F3OP和10×UPM混合引物(long 0.4 μmol/L 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，short 2 μmol/L：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)进行PCR扩增反应，PCR总体积20 μL (灭菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL,正负引物各1 μL)，PCR反应条件:94 ℃预热5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 个循环； 94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s ，72 ℃ 2 min，5个循环；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．为了提高扩增条带的特异性，将得到的PCR产物稀释45倍，用移液器取1 μL为模板，然后用引物F3IP和NUP(10 μmol/L：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)进行PCR扩增反应，总体积20 μL ，PCR反应条件：94 ℃预热5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．用1.5%的琼脂糖凝胶电泳扫胶，用小刀快速切下目的条带，克隆后送上海生工公司测序．

1.3.2 RT-PCR检测FUCA1基因的表达 已经达到性成熟的黄鳝被断头放血数分钟后，立即用镊子摘取2种不同的性腺组织：卵巢和精巢．用OMEGA公司的总RNA提取试剂盒提取不同性腺组织的总RNA．根据先前已经克隆出来的黄鳝FUCA1基因的核苷酸序列用Primer premier 5.0软件设计mRNA水平上所需要的表达引物E-1、E-2(表1)．进行PCR反应总体积为20 μL (2×Taqmix溶液10 μL，water 6 μL，cDNA模板2 μL，正负特异引物各1 μL)．PCR反应条件：94 ℃预热5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35 个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存．最后用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测目的条带，以β-actin为实验内参．

表1 PCR表达引物及其引物序列Tab.1 The primers and their sequences of PCR

2 结果

2.1 黄鳝FUCA1基因核苷酸和氨基酸序列

采用从黄鳝性腺提取的总RNA进行RT-PCR．按照已经报道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4)和鼠FUCA1基因(GenBank accession number: nm024243.4)保守序列设计简并引物E-1和E-2．用引物E-1和E-2扩增出FUCA1部分基因片段，获得1 200左右的DNA带，克隆后酶切鉴定、测序，序列长度为1 175 bp序列(图1)．利用在线软件SMART对本实验所克隆出来的FUCA1基因部分序列进行对比分析，其结果表明该序列包含了3个跨膜结构域(图2)．

图1 黄鳝FUCA1基因核苷酸及蛋白质序列Fig.1 FUCA1 gene nucleotide and amino acid sequence of ricefield eel cDNA

图2 SMART软件分析图Fig.2 SMART software analysis chart

2.2 FUCA1在黄鳝雌雄性腺组织mRNA表达水平检测结果

提取黄鳝的卵巢、精巢，先后进行了3次重复的RT-PCR实验，检测了FUCA1基因在不同组织中的表达，并使用生物软件GEL-PRO对3次PCR产物的凝胶图进行了半定量灰度分析.PCR扩增图谱显示，FUCA1基因可在黄鳝的精巢和卵巢组织中检测到，其在卵巢中的mRNA的表达量高于在精巢组织(图3)．

图3 FUCA1基因在黄鳝2种不同组织中mRNA水平的表达(1.精巢；2.卵巢)Fig.3 The mRNA expression of FUCA1 in ricefield eel different tissues(1.testis; 2.ovary)

3 讨论

目前哺乳动物的Sry基因、鸡的Dmrt1基因、青鳉Dmy基因和爪蟾Dm-w基因被认为是脊椎动物性别决定的关键基因，研究人员通过分析比对这些脊椎动物的外显子-内含子基因结构，有趣地发现，青鳉的Dmrt1、Dmy和爪蟾的Dm-w、Dmrt1基因都含有非编码型的第一外显子，而小鼠和鸡的Dmrt1却没有[6]．黄鳝是一类雌性先熟的雌雄同体鱼类，其性别发育方向为单方向进行，随着卵巢的败育，逐渐过渡到雄性发育[ 7-8]．20世纪90年代初，刘建康在研究黄鳝繁殖习性中首次报道了黄鳝的性逆转现象[9]．但是到目前为止，我们对其性逆转的分子发育机制还不甚了解．最新实验研究表明，动物的性别决定是一个由多基因共同调控的复杂过程．在人和哺乳动物性别决定机制方面，位于Y染色体上的Sry基因被认为是性别决定的关键基因[10-11]．周荣家等以人Sry基因序列合成PCR引物，以黄鳝DNA为模板进行PCR扩增，并经随机引物法DIG标记的人Sry基因探针进行Southern印迹杂交，结果表明黄鳝基因组存在人的Sry同源基因[12]．在黄鳝的基因组以及cDNA中克隆了两个Sox9基因，这两个基因在黄鳝3种性腺中的表达图式一致，但是特异地出现在具有双向分化潜能的性腺上皮的外侧，这提示了它们在黄鳝性反转的性腺分化中有着重要的作用[13-14]．此家族的Sox17基因主要在黄鳝的3种性腺、脑、脾中表达，表明可能参与黄鳝性逆转[15]．商璇等也发现核糖体蛋白93不但具有管家基因的功能，还涉及参与了调控性腺分化等发育过程[16]．在黄鳝的不同发育时期，荧光定量技术显示了芳香化酶基因P450arom和P45011β表达量存在差异，进一步说明类固醇在黄鳝性逆转过程中起着重要作用[17]．Dmrt1b基因是目前为止唯一一个硬骨鱼类中发现的，在青鳉鱼中起性别决定的基因．研究表明黄鳝中Dmrt1基因在成体性腺中特异表达，且在性逆转的过程中逐渐升高，说明该基因可能在性反转的过程中有重大的作用[18]．黄鳝性腺发育过程中，吕道远等用RNA反义探针原位杂交技术，对vasa基因的表达也进行了研究，结果显示黄鳝的雄性生殖细胞可能起源于雌性阶段卵巢被膜中的原始生殖细胞[19]．在线虫和果蝇中，vasa基因缺失会导致阻碍卵子正常功能，精子受阻也发生在vasa基因被敲除的小鼠中[20]．本实验室之前研究工作证实ERK和JNK在黄鳝卵原细胞和精原细胞均有表达，提示在黄鳝卵母细胞发育成熟过程中，ERK和JNK可能起着重要的调控作用[21]．根据陈丽莉等报道JNK1基因在黄鳝雌性性腺组织中的表达量要远远高于雄性性腺组织中的表达量，而JNK3基因在金鱼和斑马鱼雌、雄性腺中的表达结果是精巢组织中有显著的表达，而在卵巢中未检测到[22]．所有这些都提示着：JNKs家族参与了鱼类的性别决定和性腺发育的调控过程[23]．

鱼类的FUCA1基因研究甚少，FUCA1基因在黄鳝中卵巢的表达量高于精巢，提示FUCA1基因与黄鳝的性逆转可能有密切关联．同时FUCA1还能够造成SSEA的表达量的降低，推测FUCA1可能是调控SSEA的关键酶．肖亚梅等用免疫组化对黄鳝雌雄性腺SSEA的组织细胞定位，表明SSEA在黄鳝雄性性腺中的表达量高于在雌性性腺中的[23]．在黄鳝自然性逆转过程中，是否通过α-L-岩藻糖苷酶这种聚糖途径对下游的靶基因SSEA的表达调节来控制其生殖发育呢？α-L-岩藻糖苷酶在黄鳝性逆转过程中的作用机制有待于更加深入的研究．

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