以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排为标志定量检测MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病的微小残留病和预后关系

高 超 李伟京 崔 蕾 赵晓曦 刘曙光 吴敏媛 李志刚

急性淋巴细胞白血病(ALL)是B或T淋巴细胞在分化过程中阻滞于某一不成熟阶段，并且克隆性恶性扩增的结果。免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排作为淋巴系恶性疾病的克隆性标志已被广泛应用，为临床上PCR方法检测微小残留病(MRD)最常见和重要的标志［1］。国外大样本前瞻性MRD研究结果表明，定量监测MRD水平及其动态变化，能对肿瘤负荷动力学做出精确的分析，更好地反映疾病过程、评价治疗效果，有助于预后判断、完善白血病的临床分型及实施个体化治疗。混合谱系白血病(MLL)基因重排为造血系统恶性肿瘤常见分子/遗传学异常，见于2%～6%的儿童ALL［2］。MLL基因重排已公认为划分儿童高危ALL的标准之一，相应给予高强度化疗或造血干细胞移植，但部分患儿常规化疗也可获得长期持续缓解。因此，MRD检查在临床决策中无疑具有重要价值。本研究以Ig和TCR基因重排为靶分子，利用RQ-PCR方法监测MLL基因重排阳性患儿MRD水平，探讨其变化规律及其对临床的指导意义。

1 方法

1.1 研究对象2003年4月至2009年12月首都医科大学附属北京儿童医院(我院)血液肿瘤中心收治的MLL基因重排的ALL患儿，且有足量的临床检查剩余骨髓样本可用于Ig和TCR检测，同时具有MRD检测结果。

1.2 知情同意和伦理 本文检测ALL患儿Ig和TCR取得了监护人的知情同意，研究方案获得我院伦理委员会的批准。

1.3 分组 根据诱导治疗结束时骨髓MRD水平作为分组依据，MRD≥10-4为MRD阳性组，＜10-4为MRD阴性组。1.4 基因组DNA的提取 按照DNA提取试剂盒(安徽优晶)说明书提取骨髓基因组DNA，紫外分光光度计检测A260和A280，计算两者比值和 D NA浓度。DNA浓度(μg·μL-1)=A260×50×稀释倍数/1 000。

1.5 Ig和TCR基因重排及连接区序列分析 利用多重PCR反应筛查Ig和TCR基因重排，包括:①IgH:VH-DHJH，DH-JH;②IgK:VK-JK，VK-Kde，Intr-Kde;③IgL:Vλ-Jλ;④TRD:Vδ-Dδ-Jδ，Vδ-Jδ，Vδ-Dδ，Dδ-Dδ;⑤TRG:Vγ-Jγ;⑥TRB:Vβ-Dβ-Jβ，Vβ-Jβ，Dβ-Jβ。PCR 条件为:95℃ 7 min，95℃变性 4 5 s，60℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35 个循环。所用引物及反应体系见文献［3］。PCR产物经电泳后，选择克隆性重排的样本，纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司，采用ABI PRISM 3730型测序仪进行测序。然后将测序所得的DNA序列输入BLAST和IMGT数据库与保守的VDJ序列进行比对，未比对上的序列为患者白血病细胞特异性连接区序列。

1.6 以患儿特异性Ig和TCR基因重排序列为靶标进行MRD追踪 以患儿特异性IgH，IgK，IgL，Kde，TRB，TRG及TRD基因重排为标志设计白血病细胞特异性引物。采用阴性对照DNA，10倍系列稀释ALL患儿初诊时骨髓细胞DNA，制备10-1～10-5共5个梯度的系列标准品(设0.2μg·μL-1为100稀释度)。应用标准曲线，根据随访期标本的Ct值自动得出相应的拷贝数，取平均拷贝数除以该样本扩增 N -ras基因得到的拷贝数，即为 M RD 定量值［4，5］。对于重复检测3次的平均Ct值﹥可重复敏感度(10-4)的最大Ct值的样本，依据欧洲 A LL MRD检测研究组织(ESG-MRD-ALL)推荐的标准，定义为+，即 ＜ 10-4。25μL RQ-PCR反应体系中含有RoxMix 12.5μL，上下游引物各7.5 pmol，探针 5 pmol，DNA 600 ng。反应条件为 9 5℃15 min，95℃ 3 0 s，56～60℃ 1 min，共50 个循环。家族性引物和探针序列见参考文献［6～12］。

1.7 以MLL基因重排融合mRNA为靶标进行MRD追踪将含有融合转录本的质粒依次稀释，制备成102～106拷贝·μL-1的标准品，应用标准曲线，得到随访期标本的拷贝数，并以ABL基因作为内参。以每104ABL中含有的目的基因拷贝数作为 M RD值。25μL体系中含有RoxMix 12.5μL，上下游引物各 7 .5 pmol，探针 5 pmol，cDNA 80 ng。反应条件为 9 5℃ 15 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，共50个循环。引物及探针序列见表1。

1.8 统计学分析 应用SPSS 16.0 for windows软件进行统计分析。利用精确概率法χ2检验比较诱导缓解治疗结束时MRD高低水平两组初诊临床特征及对泼尼松实验治疗敏感性的差异。利用Spearman＇s相关性分析比较两种方法检测MRD结果的相关性。生存率分析采用Kaplan-Meier法;MRD不同水平组间无事件生存率(EFS)的比较采用Log-Rank检验。随访时间定义为自诊断之日至发生事件之日或研究观察终止之日。事件定义为死亡、复发或第二肿瘤。(P＜0.05)为差异有统计学意义。

表1 以MLL融合基因为分子标志检测MRD所用引物与探针Tab 1The primers and probes used in MRDdetection withMLLfusion transcripts as targets

2 结果

2.1 一般情况2003年4月至2009年12月我院血液肿瘤中心收治的24例MLL基因重排ALL患儿，年龄6个月至11岁10个月，中位年龄2岁4个月。B-ALL 21例，T-ALL3例。其中4例在确诊后放弃治疗，14例在我院接受BCH-2003方案、6例接受CCLG-2008方案规范性化疗。其中14例在诱导治疗结束时(开始化疗后第33天)进行了MRD检测进入分析，其中9例长期缓解，5例复发。

2.2 MLL重排阳性患儿MRD的水平 表2显示，14例在诱导化疗结束时，即化疗开始后第33天，进行了以Ig和TCR为标志的MRD检测，MRD水平为0～7 770×10-4，中位数为4.85×10-4。9例长期缓解患儿MRD水平低于5例复发患儿(＜10-4vs 448×10-4)。14例同时进行了该时间点融合转录本的定量检测，检测水平从0至4 020.1拷贝·10-4ABL，中位数为7.91拷贝·10-4ABL。复发患儿融合转录本定量水平显著高于长期缓解患儿，中位数前者为1.09拷贝·10-4ABL，后者为322.5拷贝·10-4ABL。两种方法的相关性为0.942，(P＜0.05)。

表2MLL基因重排阳性患儿MRD与临床特征Tab 2The MRD and clinical characteristics of patients withMLLgene rearrangments

2.3 MLL重排阳性患儿MRD与临床特征的关系 诱导缓解治疗末MRD阳性组8例中男7例，MLL-AF4+4例，其他MLL重排4例，BCH-2003方案5例，CCLG-2008方案3例;MRD阴性组6例中男4例，MLL-AF4+3例，其他MLL重排3例，BCH-2003和CCLG-2008方案各3例。MRD阴性组5/6例初诊时外周血WBC＜100×109·L-1，MRD阳性组1/8例WBC＜100×109·L-1。MRD阴性组6例第8天外周血幼稚细胞绝对值均＜1 000个·μL-1，MRD阳性组中4/8例外周血幼稚细胞绝对值＜1 000个·μL-1。

2.4 MLL重排阳性患儿MRD与预后的关系14例在诱导缓解治疗结束时进行了MRD检测患儿随访3～132个月，中位时间为64个月，5年EFS为(63.5±13.2)%。图1显示，MRD阳性组和阴性组间EFS存在显著差异(P=0.022)，MRD阴性组目前全部缓解，而MRD阳性组5年EFS为(37.5±17.1)%。

图1 MRD阳性组与阴性组生存曲线图Fig 1The events-free survival rates of patients withdifferent MRD level

3 讨论

大量研究证实，MRD的定量检测对于ALL的预后判断、预防复发具有重要意义。本研究对两种MRD标志，即Ig和TCR以及融合转录本，进行检测。结果显示，两种方法的检测结果高度一致，提示在临床应用中，可任选其一对患儿进行MRD追踪。此外，在ALL治疗中的关键时间点进行连续的MRD检测，能对肿瘤负荷动力学作出精确的判断，有助于评估危险度，从而调整治疗方案，实施个体化治疗。研究表明，对诱导缓解治疗的早期反应是儿童ALL最重要的预后因素之一。BFM协作组自1986年起将泼尼松实验治疗反应作为评价早期治疗反应的方法，泼尼松实验治疗反应良好的患者预后较好，而反应差者则预后较差。但泼尼松实验治疗仅反映了白血病细胞对糖皮质激素的敏感性，这对于准确判断预后是不够的。诱导缓解治疗结束时的MRD水平反映了患者对4种化疗药物的综合疗效(泼尼松/地塞米松、长春新碱、柔红霉素和左旋门冬酰胺酶)，以及目前尚未认识的机体抗白血病机制和耐药等方面信息，因此这一时期的MRD检测将有助于区分出预后不同的患儿。有研究指出，诱导缓解治疗结束时MRD呈阴性或低水平(＜10-4)的患儿，提示体内白血病细胞对化疗敏感，预后较好［13，14］。

本研究检测了14例患儿诱导缓解治疗结束时的MRD，结果表明该时间点MRD阴性和阳性患儿相比，生存率上存在显著性差异，MRD阴性患儿目前均处于骨髓形态学完全缓解状态，而 MRD阳性的患儿5年 EFS仅为37.5%。此外，MRD阴性患儿泼尼松实验治疗的反应均较好，第8天外周血幼稚细胞绝对值均＜1 000个·μL-1;而MRD阳性患儿仅50%反应良好，MRD阴性组的泼尼松治疗反应有好于阳性组的趋势(P=0.085)，需要增加病例数继续观察。

既往的研究表明，性别、年龄、初诊时外周血WBC计数等临床特征都是影响白血病预后的因素。对来自11个协作组的497例MLL重排阳性患儿的研究显示，年龄是重要的预后因素，≤1岁的预后差于 ＞1岁者［15］。性别仅对MLL-ENL+患儿有影响，女性的 5年 EFS低于男性［16］。NOPHO协作组对1 425例儿童ALL的研究发现，高WBC计数与MLL重排相关［17］。此外，对不同亚型影响预后的研究显示，MLL-AF4+和MLL-AF9+患儿的预后差于MLLENL+的患儿［16］。但这些研究并未揭示 MLL重排阳性者中MRD水平与临床特点的相关性。本研究中，比较了MRD水平不同的两组患儿以上临床特点的差异。结果显示，两组初诊时外周血WBC与MRD水平有关，MRD阳性组WBC≥100×109·L-1患儿占87.5%;而MRD阴性组这一比例仅为16.7%。提示，初诊时肿瘤负荷严重的患儿，更不容易获得缓解。但两组在性别、年龄及融合基因类型上均无差异。

此外，由于本组患儿中使用了两种不同的化疗方案，即BCH-2003方案和CCLG-2008方案，两种方案在诱导缓解治疗阶段的药物和剂量大致相同，区别在于CCLG-2008方案在7d泼尼松实验治疗结束后，改用地塞米松继续治疗，而BCH-2003方案则继续使用泼尼松。有报道显示体外实验中地塞米松抗ALL的作用为泼尼松的16倍，而且地塞米松有更好的预防CNS复发和提高无病生存率 (85%vs 77%，P=0.002)的作用［18］，有逐渐取代泼尼松用于诱导治疗的趋势。

本研究结果显示两种方案对诱导缓解治疗结束时的MRD结果没有影响，提示此时间点MRD的结果是多种药物联合作用的结果，地塞米松与泼尼松对MLL重排患儿白血病细胞的作用效果相近。

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