高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中相关物质含量

贺 颖，董得时(大连医科大学附属第一医院药学部，辽宁大连 116000)

醋酸泼尼松为一种肾上腺皮质类激素药，能够抗过敏、抗炎、抗风湿及免疫抑制，是临床上的常用药之一。《中华人民共和国药典:二部》(2000年版)中收录的醋酸泼尼松片含量测定方法为紫外分光光度法［1］，虽然此法简单，但其选择性较差，专属性不强，结果可能受片剂中的其他添加剂或辅料的干扰，而对于一些有意的造假产品，也常常出现“合格”的检测结果。因此本文笔者根据相关资料［2-5］及《中华人民共和国药典》(2010年版)中醋酸泼尼松原料药有关物质检查方法，采用高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松的含量，现报告如下。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪(美国，2487型紫外检测器、1525型输液泵、717自动进样器、2996型检测器、waterts Empower色谱软件)，电子天平(SartorisBS110S十万分之一天平)。

醋酸泼尼松对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100012-200105);泼尼松对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100199-199401);醋酸可的松对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100123-200303);醋酸泼尼松片(规格:5 mg);乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 ZORBAX SB C18(规格:4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(58∶42)，流速为 1.0 mL·min-1，柱温30℃，检测波长为240 nm，进样量取10 μL。醋酸泼尼松的色谱图如图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松对照品至25～50 mL容量瓶中，加流动相溶解，定量稀释至各含0.5 mg·mL-1的混合溶液，精密吸取1 mL，置于100 mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

图1 醋酸泼尼松HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of prednisone acetate

2.3 供试品溶液的制备

取本品20片，研细，精密称取约相对于醋酸泼尼松12.5 mg，置于50 mL量瓶中，加入30 mL流动相振摇20 min使之溶解，加入流动相至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液则为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

分别取醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松对照品溶液1.0、2.5、5、10、20、30、40 μL 进样，测定，横坐标为浓度(C)，纵坐标为峰面积(A)，进行线性回归。得回归方程:A醋酸泼尼松=0.77C-5.03 ×10-3，A泼尼松=0.91C-5.26 × 10-3，A醋酸可的松=0.69C-4.85×10-3，r=0.999 9。结果显示醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松在浓度范围0.52～30.81 μg·mL-1之间有良好的线性关系。

2.5 重复性试验

精密称取同一批号供试品分别按“2.3”项下方法制备5份，在上述色谱条件下进样，测得醋酸可的松平均含量为9.812 6 mg·g-1，峰面积RSD=1.0%，说明本法的重复性佳。

2.6 精密度试验

精密吸取同一批号供试品溶液10 μL，依法进样5次，测得泼尼松平均峰面积为0.202 8，RSD=1.22%，说明仪器的精密度佳。

2.7 稳定性试验

分别在 0、1、2、4、8、12 h 精密吸取同一供试品溶液10 μL，进样测定，泼尼松在12 h内平均峰面积为0.217 6，RSD=1.12%，说明供试品溶液在室温12 h内的稳定性佳。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量供试品6份，精密加入醋酸泼尼松对照品5 mg，按“2.3”项下制备回收率试验溶液，依法测定，计算回收率，见表1。

2.9 相关物质的测定

按照“2.1”项中色谱条件，量取对照溶液20 μL进样，调节检测灵敏度，使醋酸泼尼松的峰高为满量程的20%。精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μL，进样，记录色谱图到主成分峰2倍保留时间。若在供试品溶液色谱图中出现与对照品溶液中泼尼松、醋酸可的松保留时间相同的峰，则根据外标法计算其峰面积，其含量分别不得大于0.5%、1.5%。各杂质峰面积总和不得超过对照品溶液中醋酸泼尼松峰2倍面积。供试品溶液色谱图中去除相对主峰保留时间0.44倍前的辅料峰及小于醋酸泼尼松峰面积0.01倍色谱峰。10个厂家的样品测定结果见表2。

表1 加样回收试验结果Tab 1 Results of recovery test

表2 醋酸泼尼松片中相关物质含量的检测结果(%)Tab 2 Determination results of related substances in Prednisone Acetate Tablets(%)

3 讨论

本研究中采用研磨溶解，能够将较大颗粒研成微小颗粒，从而均匀分散于溶剂中，其分散性较好，利于醋酸泼尼松溶出率的提高，因此结果的准确度高，大大降低了实验方法中的误差［6］。

通过Waters高效液相色谱仪检测，醋酸泼尼松、泼尼松与醋酸可的松的最大吸收波长均为240 nm，故选择检测波长为240 nm。以甲醇-水(58∶42)为流动相能有效分离，最终获得满意结果。因醋酸泼尼松、泼尼松与醋酸可的松均溶解于流动相中，故以流动相作为溶剂。

由图1可见，醋酸泼尼松供试品溶液在3 min左右出现1杂峰，在同样条件下对照品溶液在该处却无吸收峰，说明在240 nm下运用紫外分光光度法未能排除醋酸泼尼松片中的添加剂及辅料等，故对醋酸泼尼松吸收度产生干扰而可能影响测定结果，但采用HPLC因将醋酸泼尼松与其他杂质分离，因此不受到干扰。

由于水与甲醇混合时形成空气过饱和溶液，此时会产生大量气泡并释放热量［7］，故需放置待气泡散尽冷却后使用。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部［S］.2000年版.北京:化学工业出版社，2000:1023.

［2］ 陈 杰，李 展.HPLC测定盐酸安非他酮片的含量［J］.华西药学杂志，2009，24(5):534.

［3］ 周益芬，刘 峰，杨 蕾.HPLC测定盐酸阿扑吗啡舌下片的有关物质［J］.华西药学杂志，2009，24(4):419.

［4］ 戴向东，滕南雁，桑 彤.穿心莲片含量测定(薄层色谱扫描法)的测量不确定度评定［J］.药物分析杂志，2005，25(12):1556.

［5］ 王 玉，潘晞陵.药品检测中的片剂重量差异不确定度估算［J］.药物分析杂志，2005，25(6):706.

［6］ 刘建萍.醋酸泼尼松片含量测定方法的探讨［J］.西北药学杂志，2005，20(5):F0003.

［7］ 姜文霞，李 静，吕 毅.高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片的含量［J］.宁夏医学杂志，2003，25(3):160.