黑色素瘤抗原-1诱导特异性抗肝癌免疫应答

黄明宜，刘 宾，何 炜

1)河南中医学院 郑州 450046 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052

肿瘤免疫治疗是肿瘤生物治疗的方法之一[1]。肿瘤的免疫治疗是采用各种方法提高人体免疫系统的作用,从而达到遏制肿瘤生长、破坏肿瘤细胞甚至消灭肿瘤细胞的目的。人体对抗肿瘤的免疫效应机制包括两个方面：非特异性免疫和特异性免疫；前者包括巨噬细胞、NK细胞和多种细胞因子；后者包括体液免疫和细胞免疫两方面。临床上已用IFN-γ、IL-2等细胞因子诱导免疫应答，并采用生物治疗的方法来治疗肿瘤，但其特异性不强，且毒副作用明显。因此，需要发现特异性更高、更安全有效的方法来提高人体的免疫应答能力。黑色素瘤抗原-1(melanoma antigen-1，MAGE-1)蛋白是用T细胞毒方法鉴定的第一个人类癌睾抗原。在许多体外实验已证实[2-6]，把MAGE-1蛋白作为靶位，通过树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗或基因疫苗诱导机体产生特异性免疫应答反应，可以清除肿瘤或抑制肿瘤的生长。但是，增加肿瘤细胞MAGE-1蛋白的表达能否增强肿瘤细胞的免疫原性，从而激活更多的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，引发更强的抗肿瘤效应，尚未见报道。作者将真核表达重组子pcDNA3.1-MAGE-1转染人肝癌SMMC-7721细胞，观察抗肿瘤免疫应答反应；用真核表达重组子pcDNA3.1-MAGE-1注射免疫小鼠，观察其诱发的抗肿瘤免疫效应，探讨其作为抗肿瘤DNA疫苗的可行性。

1 材料与方法

1.1主要试剂、细胞与动物淋巴细胞分离液购自上海奇康生物科技有限公司； RPMI 1640购自Hycolone公司；胎牛血清购自Corning公司；真核表达质粒pcDNA3.1和LipofectamineTM2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒购自Roche公司；rhGM-CSF、rhIL-2、rhIL-4、rhTNF-α购自R&D System公司；小鼠IFN-γ、小鼠IL-2定量ELISA检测试剂盒购自上海雄森科技实业有限公司；小鼠肝癌细胞株H22、人肝癌细胞株SMMC-7721购自武汉大学典型培养物保藏中心；雄性C57BL小鼠，22～25 g，SPF级，购自郑州大学医学院实验动物中心；pcDNA3.1-MAGE-1由郑州大学临床肿瘤实验室构建[7]；外周血取自25岁健康男性志愿者。

1.2引物及水解探针的设计目的基因MAGE-1、内参基因GAPDH的Real-time PCR 引物及水解探针均由Roche公司设计；引物由上海生工生物公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3细胞实验

1.3.1 细胞分组及处理 将SMMC-7721细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板上，当细胞贴壁面积达60%～70%时开始转染pcDNA3.1-MAGE-1重组子，按LipofectamineTM2000的操作说明书进行。转染24 h后换液，用G418(300 g/L)筛选，每2 d换液1次。设置pcDNA3.1空质粒转染对照组(空质粒组)和未转染的空白对照组。转染10 d后，空白对照组细胞全部被G418杀死，此时将G418改成维持浓度50 g/L，继续扩大培养，建立稳定表达MAGE-1融合蛋白的细胞系SMMC-7721-MAGE-1和空质粒转染细胞系SMMC-7721-pcDNA3.1。

1.3.2 各组细胞MAGE-1 mRNA表达水平的检测

取对数生长期SMMC-7721-MAGE-1、SMMC-7721-pcDNA3.1以及SMMC-7721细胞，Real-time PCR法测MAGE-1 mRNA表达水平。提取细胞总RNA。PCR反应体系包括上下游引物各0.5 μmol/L、cDNA 2 μL、水解探针0.1 μmol/L、LightCycler Taq Man Master Mix 4 μL。反应条件:95 ℃ 12 min, 95 ℃ 10 s，54 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共30个循环；40 ℃冷却30 s 结束反应。以GAPDH基因为内参。以目的基因与内参基因荧光灰度值的比值作为目的基因的相对表达量。

1.3.3 细胞冻融抗原的制备 取生长状态良好的对数生长期各组细胞，PBS缓冲液洗涤并悬浮细胞，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为1×107mL-1，移入EP管内，置于液氮中10 min，再迅速放入37 ℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，如此反复冻融3次后，15 000 r/min离心30 min，收集上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为可溶性抗原，稀释10倍，-20 ℃保存备用。

1.3.4 外周血DC的分离及致敏 外周血标本中加入RPMI 1640稀释2倍后沿管壁缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管内，2 000 r/min离心25 min，毛细吸管吸出白色单个核细胞层，加入适量RPMI 1640吹打混匀后1 500 r/min离心8 min，PBS洗涤3次。用含体积分数15%胎牛血清的双抗RP MI 1640培养液重悬细胞，接种于24孔板，每孔2×107个细胞。常规培养2 h，使DC贴壁，2 h后吸出悬浮的淋巴细胞，每孔加入rhGM-CSF(100 mg/L)、rhTNF-α(20 mg/L)和rhIL-4(10 mg/L)，置于CO2培养箱中培养，每3 d半量换液1次。第3天换液时加入冻融抗原100 μL。再3 d 后，吸取疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，置于培养瓶培养，过夜后收取悬浮细胞，即获得成熟的DC。

1.3.5 T细胞的分离及培养 待DC贴壁后，轻轻吸出上清置培养瓶中，用尼龙毛吸附法分离T淋巴细胞，培养液中加入rhIL-2(5 mg/L)，置于CO2培养箱中继续培养。

1.3.6 CTL实验 将成熟的DC与T淋巴细胞混合共培养3 d，得CTL。以CTL为效应细胞，SMMC-7721细胞为靶细胞，按效靶比401混合后接种于96孔板，培养12 h后，各组细胞离心，取上清液50 μL至另一96孔板，以42.5 μL细胞培养液+7.5 μL Lysis Solution为体积校正对照，50 μL细胞培养液为背景对照，每孔各加入50 μL Substrate Mix，室温避光作用30 min，终止反应。测量490 nm吸光度(A)值。计算CTL杀伤率[8]。

1.4动物实验

1.4.1 动物分组及免疫 将48只C57BL小鼠随机分成重组子组、空质粒组和PBS组，每组16只。免疫前3天每只小鼠在两侧股四头肌各注射2.5 g/L盐酸布比卡因50 μL。免疫方法：3组小鼠分别注射pcDNA3.1-MAGE-1、pcDNA3.1和PBS 100 μL，质粒浓度 1 g/L，两侧股四头肌每侧各50 μL，共免疫3次，每次间隔10 d。

2011年6月中旬，按照发展家庭服务业促进就业部际联席会议的要求，四川省发展家庭服务业促进就业联席会议办公室印发了《关于开展家庭服务企业摸底调查的通知》（川家服办发【2011】3号）。通过为期近两个月的工作，共收到来自成都、内江、资阳、乐山、广元、泸州、德阳、眉山、达州、绵阳、攀枝花、阿坝、凉山、甘孜14个市（州）统计上报的家庭服务企业（单位）695个。综合其他方面信息，现在全省拥有各类家庭服务机构约5000个。其中，家政服务公司3000家，公益性家庭服务组织2000个。家政服务公司主要分布在成都、绵阳、乐山等经济比较发达的城市，以中介式服务公司为主。成都已经建立96118家政服务平台。

1.4.2 小鼠脾细胞培养液中细胞因子IL-2 和IFN-γ的测定及股四头肌MAGE-1 mRNA表达检测 重组子组小鼠第3次免疫后的第3天，在无菌条件下每组各取8只小鼠脾脏。用针栓将脾脏捣碎，PBS洗涤，制成单细胞悬液,用体积分数10%胎牛血清的双抗培养液调整细胞浓度为1×107mL-1，接种于24孔板中，37 ℃、体积分数5% CO2培养48 h后，取上清液，ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-2的浓度。同时取小鼠股四头肌，半定量RT-PCR法检测MAGE-1 mRNA表达情况。

1.4.3 小鼠生存时间测定 每组剩下的8只小鼠在第3次免疫后的第6天腹腔注射接种鼠源肝癌细胞H22。接种方法：常规培养H22，取对数生长期细胞用台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为1×108mL-1，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。常规饲养，直至死亡。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0 处理数据。各组MAGE-1 mRNA的相对表达量、CTL杀伤率和各组小鼠生存时间的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1细胞实验结果

2.1.1 3组细胞MAGE-1 mRNA的表达 见表1。

见表1。

表1 3组细胞MAGE-1 mRNA表达和CTL杀伤率比较

与空白对照和空质粒组比较，P<0.05。

2.2动物实验结果

2.2.1 小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量

PBS组和空质粒组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的含量为0；而重组子组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ的含量为(372.33±10.08) ng/L，IL-2 的含量为(108.67±12.81) ng/L。

2.2.2 MAGE-1 mRNA基因在小鼠股四头肌组织中的表达 重组子组小鼠股四头肌组织表达MAGE-1 mRNA，而空质粒组和PBS组小鼠均不表达(图1)。

图1 3组小鼠股四头肌组织中MAGE-1 mRNA的表达

2.2.3 小鼠荷瘤生存时间测定结果 PBS组小鼠接种肿瘤后第10天开始出现死亡，第13天全部死亡，生存时间为(12.0±1.1) d；空质粒组小鼠接种肿瘤后第11天开始出现死亡，第16天全部死亡，生存时间为(13.1±1.7) d；重组子组小鼠接种肿瘤后第14天开始出现死亡，第20天全部死亡，生存时间为(17.4±1.6) d。3组生存时间差异有统计学意义(F=31.837，P<0.001)，重组子组小鼠生存时间比其他2组延长。

3 讨论

机体识别肿瘤进而发动免疫攻击的物质基础是肿瘤抗原。CD8+CTL通过识别肿瘤抗原来特异性杀伤肿瘤细胞。迄今已发现8个由MAGE-1基因编码的HLA-I类分子限制的CTL表位[9]，提示可利用MAGE-1制备肿瘤疫苗，并用于肿瘤的特异性免疫治疗。DC是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞, 在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中发挥至关重要的作用。其能在体内、体外激活初始型T 细胞，处于启动、调控、维持免疫应答的中心环节[10]。肿瘤细胞抗原致敏的DC既具有肿瘤特异性，又能提供激活T细胞所必需的共刺激信号，具有很强的肿瘤免疫原性。

该研究采用反复冻融法制备肝癌细胞抗原。此种抗原具有多种抗原表位,更有利于DC递呈肿瘤抗原。在DC前体期使其负载该细胞冻融抗原，肿瘤抗原被DC摄取，经过抗原处理加工成为抗原肽，被运送到DC表面，通过MHC限制性途径激活T细胞，发挥特异性抗肿瘤效应。

作者采用脂质体介导的基因转移方法将纯化的质粒pcDNA3.1-MAGE-1转染入SMMC-7721细胞，转染细胞MAGE-1 mRNA的相对表达量明显升高。同时转染细胞负载的肿瘤抗原致敏的DC诱导的CTL对SMMC-7721细胞的体外杀伤性明显增强。提示MAGE-1可增强SMMC-7721细胞的免疫原性，从而显著增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活性。

MAGE-1基因的DNA疫苗通过注射导入C57BL小鼠后，可能通过不同的方式被摄取、加工、处理和递呈给免疫效应细胞[11]。被分泌到细胞外的抗原，可以被抗原递呈细胞(包括B细胞)所摄取，加工处理后以抗原肽MHCⅡ类分子复合物的形式递呈给CD4+T细胞，刺激CD4+T细胞活化增殖。在IL-4、IL-10的作用下，CD4+Th0细胞向Th2细胞分化，一方面通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，参与B细胞增殖、成熟和促进抗体生成，增强特异性抗体介导的体液免疫应答；另一方面使部分B细胞增殖成为记忆B细胞，产生对特异抗原蛋白的免疫记忆。而在IFN-γ、IL-2的作用下，CD4+Th0细胞向Th1细胞分化，通过分泌IL-2、IFN-γ，参与TDTH和Tc细胞的增殖、分化和成熟，同时活化巨噬细胞、NK细胞，增强吞噬杀伤能力[12]。在APC内表达的抗原蛋白被加工处理以后以抗原肽MHCⅠ类分子复合物的形式呈递给CD8+T细胞，使之分化成为CTL和记忆细胞，发挥特异性细胞免疫功能和形成免疫记忆。

该研究通过对小鼠注射真核表达重组子pcDNA3.1-MAGE-1，使其在小鼠体内表达。小鼠脾细胞培养上清液中检测到INF-γ、IL-2 ，说明T细胞在向Th1细胞分化，也就是引发了小鼠MAGE-1特异性的细胞免疫应答。通过生存时间的测定，作者发现重组子组荷瘤小鼠生存时间明显延长。该研究结果预示MAGE-1在肿瘤的免疫治疗中具有极其光明的应用前景。

[1] Bolhassani A, Yazdi SR. DNA immunization as an efficient strategy for vaccination[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2009,1(2):71

[2] Pereira CM, Gomes CC, De Fatima Correia Silva J, et al. Evaluation of MAGE A1 in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncol Rep, 2012,27(6):1843

[3] Bao L, Dunham K, Lucas K. MAGE-A1, MAGE-A3, and NY-ESO-1 can be upregulated on neuroblastoma cells to facilitate cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor cell killing[J]. Cancer Immunol Immunother, 2011,60(9):1299

[4] Karanikas V, Zamanakou M, Saukou F, et al. Naturally occurring tumor-specific CD8+T-cell precursors in individuals with and without cancer[J]. Immunol Cell Biol, 2010,88(5):575

[5] Fang J, Wang G, Yang Q,et al. The potential of phage display virions expressing malignant tumor specific antigen MAGE-A1 epitope in murine model[J]. Vaccine, 2005,23(40):4860

[6] Ma W, Vigneron N, Chapiro J,et al. A MAGE-C2 antigenic peptide processed by the immunoproteasome is recognized by cytolytic T cells isolated from a melanoma patient after successful immunotherapy[J]. Int J Cancer, 2011,129(10):2427

[7] 何炜, 张朝, 章茜, 等.真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建[J]. 郑州大学学报:医学版, 2005,40(4):586

[8] 郭妍，王菊芳，罗小春，等.多表达HBV重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价[J]. 南方医科大学学报，26(12)：1803

[9] Meek DW, Marcar L. MAGE-A antigens as targets in tumour therapy[J]. Cancer Lett，2012，324(2):126

[10]Umeshappa CS, Huang H, Xie Y,et al. CD4+ Th-APC with acquired peptide/MHC class Ⅰ and Ⅱ complexes stimulate type 1 helper CD4+ and central memory CD8+ T cell responses[J]. J Immunol, 2009,182(1):193

[11]Bijker MS, van den Eeden SJ, Franken KL,et al. Superior induction of anti-tumor CTL immunity by extended peptide vaccines involves prolonged, DC-focused antigen presentation[J]. Eur J Immunol, 2008,38(4):1033

[12]Munir S, Andersen GH, Met O, et al. HLA-restricted CTL that are specific for the immune checkpoint ligand PD-L1 occur with high frequency in cancer patients[J]. Cancer Res, 2013,73(6):1764