采用基因芯片技术研究黄芪对衰老小鼠脑组织基因表达的影响

明海霞 贺志有 王香梅 王 岚 侯 茜 张 帆 (甘肃中医学院，甘肃 兰州 730001)

近年来，对黄芪影响衰老相关基因、细胞凋亡、DNA损伤的修复及端粒长度来延缓衰老的研究有所进展〔1〕。郝春光等〔2〕运用RT-PCR技术，研究黄芪对快速老化鼠相关衰老基因表达的影响。这些研究方法，多以单一或少量几个靶点的生物信息改变为研究对象，对中药多组分、多靶点、多途径的作用特点，上述研究方法，则显露出明显的局限性，对此基因芯片技术却是有益的补充。基因芯片技术具有高通量、并行性、低消耗、微型化和自动化的特点，能够高效、快速且多参量同时研究大量基因在不同刺激条件下表达的差异〔3〕。鉴于基因在衰老过程中的重要性及中药作用的整体效应，本研究采用D-半乳糖所致衰老模型小鼠，小鼠全基因组基因芯片，研究甘肃黄芪对衰老模型小鼠脑组织基因表达谱的影响。

1 材料与方法

1.1 药物制备 黄芪水煎剂的制备:取黄芪100 g(甘肃岷县黄芪，经甘肃中医学院中药系教授张西玲鉴定)，切成片，加相当于药材量8倍的冷水浸泡2 h，煮沸30 min，滤过;药渣加6倍量水煮沸20 min，滤过。合并两次煎出液，加热浓缩至100 ml，即为100%黄芪水煎剂，其浓度相当于生药量1 g/ml，置4℃备用〔4〕。

1.2 试剂与仪器 D-半乳糖购自北京索莱宝科技有限公司(产品编号D810-25);TRIzol(Invitrogen);RNasey Mini Kit(Qiagenp/n 74904);Baseline-ZERO Dnase (EPICENTRE，Cat.Nos.DB0711K);Agilent Gene Expression Hybridization Kit(Agilent p/n 5188-5242);NanoDrop ND-1000;Hybridization oven(Agilent p/n G2545A)Slide-staining dish，with sliderack(Thermo Shandon p/n 121);包含41000个基因的Agilent小鼠全基因组表达谱芯片(Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray 4×44K)Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)。

1.3 造模及分组 昆明种小鼠30只，2～3月龄，体重18～22 g，雌性，由甘肃中医学院动物中心提供，SPF级。适应性喂养1 w后，分笼群养，自由饮水、摄食，自然光照，室温20℃ ～25℃，湿度45% ～55%。随机分为3组，空白组、模型组、黄芪组，每组10只。除空白组外，其余各组每只颈背皮下注射5%D-半乳糖120 mg·kg－1·d－1，连续 6 w〔4〕，造成衰老模型。空白组颈背皮下注射同等剂量生理盐水。造模的同时，空白组和模型组每只每天灌服生理盐水0.5 ml，黄芪组小鼠按黄芪煎液18 g·kg－1·d－1灌胃 (相当于 60 kg的成人临床最大用量的12倍)。

1.4 标本制备 连续给药6 w后，于最后1 d灌胃和注射D-半乳糖2 h后，颈椎脱臼处死，立即取出脑组织，切取海马区组织50～100 mg加入1 ml的TRIzol试剂用玻璃匀浆器匀浆，置－20℃冰箱备用。同时取肝组织测定超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)，方法按试剂盒说明进行(测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。

1.5 总RNA提取、纯化 按Trizol(Invitrogen life technologies)法提取脑组织细胞中的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，并进一步采用QIAGEN RNase试剂盒纯化总RNA，详细操作方法按试剂盒说明，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。基因芯片试验，由上海康成生物完成。

1.6 扫描与分析 芯片扫描用美国安捷伦公司的基因芯片扫描仪，单色扫描，芯片数据通过安捷伦公司的影像分析转换软件(版本号10.5.1.1)把图像信号转化为数字信号，再通过GeneSpring GX软件(版本号10.0)进行后期数据处理。数据用Lowess方法进行归一化;最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因。

2 结果

2.1 抗衰老小鼠模型的构建 造模2 w后，模型组小鼠开始出现精神萎靡、食量下降、行动迟缓、毛发枯黄、失去光泽、皮肤松弛弹性下降等一系列的衰老症状，而药物组、空白组则精神状态良好、行动敏捷、毛色白、光滑、皮肤弹性良好。经过7 w的造模后这些症状更加明显。与空白组比较，衰老模型组小鼠肝中MDA含量明显增加，SOD、GSH-Px活性明显降低;与模型组比较，黄芪组小鼠肝脏组织中MDA含量显著降低(P＜0.01)，肝脏SOD活力和GSH-Px活力明显增高(P＜0.01);表明黄芪水煎剂能显著增高衰老小鼠肝脏中SOD、GSH-PX活力和降低MDA含量，有明显抗氧化作用，根据文献报道说明此次造模是成功的〔5〕。见表1。

表1 黄芪水煎剂对小鼠肝组织SOD，MDA，GSH-Px的影响( s，n=10)

表1 黄芪水煎剂对小鼠肝组织SOD，MDA，GSH-Px的影响( s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.01

组别SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH-Px(活力单位)空白组 128.55±23.851) 5.68±2.271) 33.62±8.651)模型组 100.09±19.69 10.98 ±3.81 21.65 ±8.92黄芪组 129.41±20.651) 3.84±1.571) 34.29 ±7.801)

2.2 不同组小鼠脑组织总RNA提取、纯化质量的检测结果变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察并拍照，结果显示(图1)，28 S和18 S核糖体RNA的带非常亮而浓，两个条带间的亮度之比基本符合2∶1。还观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其他异型RNA组成。

用紫外分光光度计测定260 nm、280 nm和230 nm的吸光度(OD)值，通过计算得出:(1)OD260/OD280＞1.96，说明蛋白质污染极少;(2)OD260/OD230＞1.97，说明异硫氰酸胍等盐类污染极少;(3)按照1OD260=40 μg RNA/ml计算，各组总体RNA产率接近，大约都在2 μg RNA/mg组织。从照片和OD值分析，所得总体RNA的纯度和完整性均较好，适宜进行mRNA纯化及杂交分析。

2.3 芯片扫描图 根据实验要求对所提取的3组小鼠脑组织RNA样品在3张包含41 000个基因的Agilent小鼠全基因组表达谱芯片(Agilent Whole Mouse Genome OligoMicroarray 4×44 K)上分别进行杂交后，基因芯片扫描图如下(图2，本试验为单色Cy3标记)每一个点代表一个基因的表达，亮度越高就代表表达量越高，不同位置代表不同探针。根据不同的亮度显示应用专业的扫描软件进行表达量的对比，筛选出差异基因。右侧上图是芯片左上角、下图是中间部分扫描图的放大。

2.4 差异表达基因的分析 黄芪组与模型组比较有3 744个差异表达基因，其中2 235个表达上调，1 509个表达下调;黄芪组与空白组比较有2 771个差异表达基因，其中1 576个表达上调，1 195个表达下调;模型组与空白组比较有924个差异表达基因，其中454个表达上调，470个表达下调。

通过比较分析模型组与空白组、黄芪组与空白组、黄芪组与模型组差异表达的基因，获得在衰老小鼠中，表达水平受黄芪用药影响的基因。对模型组与空白组比较，筛选出29个基因，其中未知基因14个，已知基因15个，上调基因5个，下调基因10个。这15个基因，在黄芪组中有4个表达与模型组一致，11个表达有显著差异。见表2。

表2 与空白组比较在模型组和黄芪组表达有显著差异的部分基因列表

对黄芪组与空白组比较，另外筛选出21个只在黄芪组表达的基因，其中未知基因8个，已知基因13个，上调基因9个，下调基因4个〔6〕。见表3。

表3 只在黄芪组表达的部分差异基因列表

3 讨论

本文筛选出15个与衰老相关的基因，其中4个在黄芪组与模型组表达一致，11个表达有显著差异，另外，筛选出13个只在黄芪组中有明显表达差异的基因，这些基因与衰老没有直接的相关性，但可能与黄芪延缓衰老的作用机制有关〔7，8〕。

在本实验中，与衰老有关的15个基因参与的生物学过程，主要有:细胞的代谢过程，免疫应答，生物大分子的修饰，蛋白质的磷酸化，蛋白质的运输，DNA的转录，对DNA损伤的应答，细胞的生物合成，离子的跨膜转运，细胞骨架，细胞连接，神经原细胞突轴的发育;细胞通讯，神经冲动的传导，中枢神经系统的发育，髓鞘的形成，神经细胞的分化、凋亡等;表明经D-半乳糖作用后，小鼠表现出以上生物学功能的衰退。经黄芪治疗后，涉及以上生物学过程的基因表达发生改变，表明黄芪对衰老治疗的机制可能是通过干预衰老相关基因表达的调控进行的。另外，通过黄芪组与空白组比较，筛选出13个只在黄芪组中有明显表达差异的基因，这些基因与衰老没有直接的相关性，但它们涉及以下生物学功能:细胞内的信号转导，核酸的生物合成，DNA损伤的修复，抑制神经细胞的凋亡，微管的形成，促进细胞的代谢活动，促进细胞的信号传导，参与神经元的分化及发育，脑的发育等生物学过程，这些基因在黄芪组与空白组中表达有明显差异，而在模型组没有表达，我们认为，黄芪可能通过对这些基因表达的调控，延缓衰老。从延缓衰老的基因水平现有研究进展来看，延缓衰老作用并非是作用于单一基因，而是一极其复杂的生物过程，是一连串基因激活与阻抑，通过各自产物相互作用，与内、外环境交互影响的结果。这些研究从不同角度提出了延缓衰老的机制，但是对于延缓衰老来说所要解决的问题还很多，需要我们在现有研究的基础上多途径，多角度地探索。

本文结果表明黄芪通过多途径、多层次、多靶点的整体调整作用，改善DNA修复功能，纠正凋亡调控机制的紊乱，促进组织的修复，同时改善了信号的传递，并从基因转录水平反映了黄芪的整体良性调整作用。对于这些基因与衰老程度的关系以及和黄芪用药的线性关系的进一步深入研究，还需定量PCR技术进一步检测，给出定量关系，为揭示黄芪抗衰老的作用机制奠定基础。

1 李 静，陈 超.黄芪抗衰老作用分子机制的研究进展〔J〕.中国现代药物应用，2008;2(2):92-3.

2 郝春光，徐 丹，习杨彦彬，等.黄芪抗脑衰老作用的研究〔J〕.解剖科学进展，2008;14(1):47-50.

3 叶 芳，苑伟政.基于基因表达谱芯片的人参对衰老脑组织作用研究〔J〕.西北工业大学学报，2006;24(5):667-71.

4 李仪奎，金若敏，王钦茂，等.中药药理实验方法学〔M〕.第2版.上海:上海科学技术出版社，2006:119.

5 张 熙，李文彬，张炳烈.D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，1990;4(4):309-10.

6 余榕捷，蒲含林.利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2004;20(2):260-5.

7 杨裕华，李 震.金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型以药反证的脑基因芯片研究〔J〕.中国中药杂志，2009;34(9):1124-8.

8 贾 鹏，张 平，于小华，等.黄芪甲甙干预大鼠肺纤维化相关基因的时空表达〔J〕.现代生物医学进展，2010;10(7):1227-31.