糖尿病大鼠胃肠排空与心房利钠多肽的相关性

刘世雄 刘世宝 赵 丽 严 祥 王 晶 (兰州大学第一医院老年科，甘肃 兰州 730000)

糖尿病患者往往伴有胃肠动力障碍，多表现为胃肠排空延迟、蠕动减慢，但其病理机制至今尚未完全阐明。近年研究发现心房利钠多肽(ANP)广泛存在于胃肠道并参与调节胃肠道的吸收、分泌和运动〔1，2〕。血糖升高后ANP的分泌也会增加，然而糖尿病胃肠动力障碍是否与ANP的变化有关目前尚不清楚。本文探讨ANP在血浆和胃窦平滑肌的变化并分析其与胃肠排空延迟的关系。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分组 8周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只(购自兰州大学动物实验中心)，体重约180 g，随机分为对照组、单纯肥胖组和糖尿病组。对照组喂以常规饲料，饮用自来水，单纯肥胖组、糖尿病组大鼠喂以高糖高脂饲料(猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸钠1%，常规饲料66.5%)，饮用120 g/L果糖水。喂养8 w测定体质量、血糖后，禁食不禁水12 h，糖尿病组腹腔一次性注射30 mg/kg链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，对照组、单纯肥胖组腹腔注入同等体积的枸橼酸缓冲液。继续喂养4 w，糖尿病组大鼠以空腹血糖大于16.7 mmol/L为造模成功。成模后对照组、单纯肥胖组大鼠分别为8、11只，糖尿病组为13只。

1.2 胃肠排空的测定 12 w后大鼠禁食不禁水24 h，再次称体重、测血糖后用浓度为0.5 mg/ml的5%葡萄糖酚红溶液1.5 ml灌胃，灌胃后30 min后处死大鼠，打开腹腔，快速结扎贲门、幽门和回盲部，分离胃、小肠，并将小肠拉直后分为近(40%)、中(30%)、远(30%)三部分。分别剖开胃、小肠各段，以蒸馏水冲洗内容物，定容为20 ml，而后加入0.5 mol/L氢氧化钠20 ml搅拌混匀，静置后取5 ml上清液加入三氯乙酸去蛋白，3 500 r/min 4℃离心10 min。取上清液用分光光度计在560 nm波长下测定吸光度值。另取酚红溶液先后加入蒸馏水、氢氧化钠、三氯乙酸搅拌混匀，测定吸光度值为标准酚红吸光度值。按下式计算各段酚红残留率:酚红残留率(%)=(各段酚红残留量/胃肠内酚红总残留量)×100%。

1.3 放免法测定血浆ANP浓度 在0、8、12 w分次采血，取血浆放入－70℃冰箱保存备检。试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。

1.4 胃窦肌层ANP阳性细胞光密度的测定 取大鼠胃窦-幽门处胃组织固定、包埋后切片、染色，计算机辅助图像分析观察胃窦平滑肌层中阳性细胞的染色及分布情况并得到阳性表达光密度，取同期大鼠心脏切片设立阳性对照。

2 结果

2.1 一般情况 8 w后单纯肥胖组和糖尿病组大鼠体质量较对照组显著增加(P＜0.05)，糖尿病组和单纯肥胖组之间差异无显著性(P＞0.05)。单纯肥胖组和糖尿病组血糖有所增高，但与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。注射STZ或枸橼酸缓冲液4 w后，糖尿病组大鼠血糖水平升高达到糖尿病诊断标准，与对照组及单纯肥胖组比较差异有显著意义(P＜0.05)。单纯肥胖组与对照组比较血糖水平差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.2 胃肠排空的变化 见图1，灌胃后30 min糖尿病组大鼠胃和近段小肠内酚红残留率均多于对照组和单纯肥胖症(P＜0.05)，而中段和远段小肠酚红残留率均少于对照组和单纯肥胖症(P＜0.05);对照组和单纯肥胖症胃和小肠各段酚红残留率两组比较无意义(P﹥0.05)。

2.3 血浆ANP的变化 见表1，与对照组和单纯肥胖组相比，8 w后糖尿病组血浆ANP的浓度无变化，但12 w后ANP的浓度较对照组和单纯肥胖组显著升高(P＜0.05)。而对照组和单纯肥胖组之间差异不显著(P＞0.05)。

表1 0、8、12 w各组大鼠体质量、血糖及血浆ANP、胃窦肌层ANP阳性细胞光密度值比较(s)

表1 0、8、12 w各组大鼠体质量、血糖及血浆ANP、胃窦肌层ANP阳性细胞光密度值比较(s)

与对照组比较:1)P＜0.05;与单纯肥胖组比较:2)P＜0.05

1.4 83.2±9.8 4.203±0.137单纯肥胖组11174.46±10.71 359.86±22.76 459.28±29.03 5.70±1.42 7.05±0.92 7.98±0.77 81.3±11.5 86.2±9.6 84.7±10.1 4.981±0.075糖尿病组 13 175.46±9.97 361.75±22.03 461.92±22.851)5.49±0.86 7.86±1.91 21.37±2.421)2)78.4±9.2 82.2±7.4 124.1±11.91)2)8.227±1.0641)2)对照组 8 178.27±11.34 253.27±10.97 382.94±13.70 5.14±1.03 6.01±1.41 5.45±0.92 79.2±9.3 83.9±1

图1 胃肠排空的变化

2.4 胃窦平滑肌层ANP阳性细胞图像分析光密度值比较见表1，在各组大鼠胃窦平滑肌层中均观察到了ANP阳性细胞，以肌间神经丛中最为广泛。在糖尿病组肌间神经丛中ANP免疫反应阳性细胞较对照组、单纯肥胖组均明显增高(P＜0.05)，光镜下见神经元胞体及神经纤维普遍着色，呈棕黄色颗粒状，胞浆着色，呈阳性或强阳性反应。而对照组、单纯肥胖组ANP神经网络稀疏，神经节密度较低，阳性细胞数较少，染色较淡呈弱阳性反应。阴性对照片在大鼠的胃神经丛内无棕黄色染色。

2.5 血浆ANP浓度、胃窦平滑肌层ANP阳性细胞光密度值与血糖、胃肠各段酚红残留率的相关性分析 通过相关性分析发现12 w后糖尿病组大鼠血浆ANP浓度与近段小肠内酚红残留率呈正相关(r=0.632，P=0.021)，而与胃、中段和远段小肠酚红残留无相关性(r=0.076，P=0.103);胃窦平滑肌层ANP阳性细胞光密度值与胃内酚红残留率呈正相关(r=0.591，P=0.035)，而与小肠各段酚红残留无相关性(r=0.168，P=0.197)。

3 讨论

ANP具有强大的利钠、利尿和拮抗肾素-醛固酮系统等作用，主要存在于哺乳动物的心房肌细胞的细胞质中。在中枢水平ANP主要是通过参与副交感神经来完成对胃肠功能的调节。除了受中枢神经系统的支配外，还发现豚鼠的胃和小肠能合ANP并通过旁分泌和自分泌形式作用于胃肠道抑制胃肠运动，这种抑制效应是通过提高细胞内cGMP水平而实现的〔3〕。通过前期的研究发现急性心肌梗死大鼠胃排空延迟与血浆ANP浓度升高有关〔4〕，同胃动素、血管活性肠肽(VIP)、生长抑素(SS)、P物质(SP)、一氧化氮(NO)等一样，ANP也是胃肠激素的成员之一，且是一种抑制性递质。

糖尿病患者往往合并胃肠道运动功能障碍，发生机制与多种因素有关，其中胃肠激素失调是主要原因之一。已经有许多研究表明糖尿病患者存在胃动素、VIP、SS、SP、NO等多种胃肠激素分泌的失调〔5～7〕。

研究显示1型、2型糖尿病患者和大鼠的血浆ANP浓度均明显升高〔8～10〕，本研究结果也证明了2型糖尿病大鼠血浆ANP浓度较对照组和单纯肥胖组均升高。然而对血浆ANP浓度升高的原因尚有不同看法。Allen等〔11〕认为血浆ANP的升高可能与血糖升高后导致的血容量增加有关。但ANP浓度的增加是否与血糖有直接关系尚不得而知，通过分析后我们未发现血浆ANP浓度与血糖存在一定的相关性。

在胃黏膜中当ANP与相应受体结合后使细胞内的cGMP水平增加。通过cGMP途径，刺激SS分泌，进而抑制胃窦部胃泌素和胃底部组织胺的分泌〔1，2〕，而SS、胃泌素的变化均可抑制胃排空。Guo等〔12〕利用放射自显影技术证实ANP受体还广泛存在于大鼠胃平滑肌层中，其中以胃窦部密度为最大。他们还进一步证实了ANP可明显抑制大鼠胃窦环行肌条的收缩。

本研究结果说明糖尿病大鼠存在液体胃排空延迟和肠通过时间延长，血浆ANP浓度及胃窦平滑肌ANP的表达增加可能是导致糖尿病大鼠胃肠道排空延迟的原因之一。

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