益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1受体表达的影响

李 艳 曹文富 (重庆医科大学中医药学院，重庆 401331)

转化生长因子β-1(TGF-β1R)是目前已知致肝纤维化最强的细胞因子，在形成肝纤维化的过程中起着至关重要的作用〔1〕。TGF-β1R 又是通过结合 TGF-β1R 来发挥作用〔2〕。肝纤维化的中医病机众多中医界人士认为其中心环节是痰浊胶结加之气虚血瘀促成。近年一些文献报道有采用益气、化瘀、化痰、养阴法治疗肝纤维化，以及四种方法结合治疗肝纤维化的文献报道。但是，益气、化瘀、化痰、养阴法四种方法单独应用和合用到底有什么疗效上的区别?我们在临床应用中到底如何在这几种方法上进行选择仍然是临床上困惑的问题，而当前对于它们之间疗效有什么差别尚无文献报道。理清这几种治疗，对于我们今后采用中医中药治疗肝纤维化过程中，如何权衡选择单独剂量治疗还是合用治疗?对于我们判断用药的选择具有非常重要的意义。而中医、西医在临床应用中到底如何在这几种方法上进行选择仍然是临床上困惑的问题，而当前对于它们之间疗效有什么差别尚无文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 雄性SD大鼠130只，清洁级，体重180～220 g，由重庆医科大学动物中心提供〔许可证号 syxk(渝)20070001〕。

1.2 药物 (1)精选中药黄芪、白术，混合水提并浓缩成益气口服制剂(每毫升含生药2 g);(2)精选中药川芎、姜黄，混合水提并浓缩成化瘀口服制剂(每毫升含生药2 g);(3)精选中药半夏、海藻，混合水提并浓缩成化痰口服制剂(每毫升含生药2 g);(4)精选中药鳖甲、白芍，混合水提并浓缩成养阴口服制剂(每毫升含生药2 g);(5)精选中药黄芪、白术、川芎、姜黄、半夏、海藻、白芍、鳖甲，混合水提并浓缩成益气化瘀化痰养阴口服制剂(每毫升含生药2 g)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 130只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组10只(纯水灌胃)、肝纤维化模型组20只(纯水灌胃)、益气组20只(益气剂灌胃)、化瘀组20只(化瘀剂灌胃)、化痰组20只(化痰剂灌胃)、养阴组20只(养阴剂灌胃)、益气化瘀化痰养阴组20只(益气化瘀化痰养阴剂灌胃)。

1.3.2 造模方法 除正常对照组大鼠给予正常普通饲料喂养外，其余各组大鼠(1)给予39.5%玉米面+40%面粉+20%猪油+0.5%胆固醇组成的高脂低蛋白饲料。(2)采用背部皮下注射CCL4油剂，每周2次，共计12 w。第1周的2次皮下注射剂量皆为0.5 ml/100 g体重，以后每次注射剂量为0.3 ml/100 g体重，安排每周星期二和星期五进行。建立肝纤维化大鼠模型，并将试验大鼠随机分入相应各组。(3)每天5%酒精作为唯一饮料。

1.3.3 给药方法 (1)各组实验大鼠中药制剂均按约3 ml/100 g剂量灌胃。(2)肝纤维化模型组:20只大鼠生理盐水灌胃(剂量约3 ml/100 g)。(3)正常对照组:10只大鼠生理盐水灌胃(剂量约3 ml/100 g)。

1.3.4 标本留取 最后一次用药后24 h，麻醉大鼠，断头处死大鼠取肝脏，取部分肝组织用10%中性甲醛溶液或二醛-锇酸双重固定，待做免疫组化或电镜检查，其余标本于液氮中冷冻后再转移到-70°冰箱中保存。

1.4 观察指标

1.4.1 肝组织形态 采用HE染色法，光镜观察肝小叶结构、肝板排列、中央静脉等。

1.4.2 Masson三色胶原染色 切片脱蜡后于0.5%碘酒精作用10 min，稍水洗，5%硫代硫酸钠作用5 min，流水冲洗10 min，Weiger氏铁苏木素染5～10 min，流水稍洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗数min，丽春红酸性品红液染5～10 min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸水溶液处理约5 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，梯度脱水，二甲苯透明、中性树胶封固。

1.4.3 RT-PCR法检测肝组织TGF-β1R mRNA表达 提取大鼠肝组织总RNA，然后在42℃ 20 min条件下逆转录为cDNA。于Genebank中查的大鼠TGF-β1R和GAPDH整个核酸序列，利用Premier5.0查得其引物并合成，退火温度55℃。PCR反应条件预变性94℃3 min，变性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃1 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min。反应结束后取PCR产物再浓度为1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯光下观察电泳结果。凝胶在Bio-Rad公司所生产的凝胶成像仪上用Quantityone4.6图像分析软件进行照相分析。各条带的相对光密度值=目的条带光密度值/内参GAPDH条带光密度值。GAPDH:上游:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT;下游:GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT，扩增 275 bp TGF-βR1:上游:CCTGCTTCTCATCGTGTT下游:CTTTGTTGTCTGCTGCTAT，扩增548 bp。

1.4.4 Western印迹法检测肝组织TGF-β1R蛋白表达 行为检测后，直接断头处死大鼠取肝脏后冻于-70℃冰箱。称取一定量的肝脏组织，进行裂解和BCA蛋白定量，组织总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性。30 g蛋白经15%SDS-PAGE胶分离后转移到PVDF膜，3%BSA室温封闭2 h，加入一抗4℃过夜，TBS-Tween洗膜后加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，加入ECL发光液，经EC检测系统检测各组TGF-β1R蛋白表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包进行数据处理，计量资料采用用方差分析和LSD检验。

2 结果

2.1 肝组织形态学 光镜下，正常组大鼠肝组织形态规则，内皮细胞外侧无基底膜存在，肝星状细胞呈梭形或杆状，肝小叶结构完整，汇管区无扩大，无纤维组织存在及炎性细胞浸润;模型组大鼠肝脏汇管区扩大，纤维组织显著增生，多数形成假小叶，肝细胞变性坏死，肝纤维化程度分期显著增高;各治疗组大鼠肝细胞变性坏死、肝小叶结构破坏和肝纤维化程度减低。见图1。

2.2 Masson三色胶原染色结果 正常对照组大鼠肝组织切片显示，肝小叶结构完整，其周围无明显胶原纤维沉积。模型组表现为重度脂肪变，肝血窦扩张、充血、水肿，汇管区纤维纤维组织增生非常明显，肝内胶原纤维组织增生明显。益气组可见肝血窦扩张、充血、水肿，肝细胞中度-重度脂肪变，肝内胶原纤维组织轻度增生。化瘀组和化痰组均可见汇管区胶原纤维组织中度增生。养阴组可见汇管区和肝内胶原纤维组织轻度增生。益气化瘀化痰养阴共同治疗组肝细胞变化不明显，肝内胶原纤维组织轻度增生。见图2。

2.3 RT-PCR检测 TGF-β1R mRNA的表达 与模型组(2.343 6±0.184 3)相比，治疗组益气、化瘀、化痰、养阴法中大鼠肝组织 TGF-β1R基因表达降低(1.964 7±0.179 8，1.746 1±0.180 8，1.743 1 ±0.192 2，1.513 7 ±0.177 8，P ＜0.01)，其中养阴法与化瘀组、益气组、化痰组相比，大鼠肝组织TGF-β1R基因表达相对明显降低(P＜0.05)。与益气、化瘀、化痰、养阴法组相比，益气化瘀化痰养阴组中大鼠肝组织TGF-β1R基因表达明显降低(1.060 3±0.161 6，P＜0.05)。正常对照组TGF-β1R mRNA为0.886 7±0.168 6。见图3。

2.4 Western印迹法检测肝组织TGF-β1R蛋白表达 与模型组(1.826 7±0.080 8)相比，治疗组益气、化瘀、化痰、养阴法中大鼠肝组织 TGF-β1R蛋白表达降低(1.533 3±0.130 1，1.266 7±0.075 7，1.326 7 ±0.041 6，1.006 7 ±0.061 1，P ＜0.01)，其中养阴法与化瘀组、益气组、化痰组相比，大鼠肝组织TGF-β1R蛋白表达相对明显降低(P＜0.05)。与益气、化瘀、化痰、养阴法组相比，益气化瘀化痰养阴组中大鼠肝组织TGF-β1R蛋白表达明显降低(0.540 0±0.052 9)，差异有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组TGF-β1R蛋白表达量为0.346 7±0.061 1。见图4。

图1 益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠肝组织的HE染色(×400)

图2 益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠肝组织的Masson三色胶原染色(×400)

图3 益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠TGF-β1R mRNA的表达影响

图4 益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠TGF-β1R蛋白表达的影响

3 讨论

肝纤维化是肝组织对慢性损伤的修复反应，是多种类型细胞、氧化应激、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果，以细胞外基质(ECM)成分的过度增生与异常沉积为主要特征〔3〕。肝纤维化作为一种慢性、进行性、弥漫性的肝脏病变，治疗不及时或治疗不当都可使其发展为肝硬化。许多文献表明，TGF-β1是目前已知致肝纤维化最强的细胞因子，在形成肝纤维化的过程中起着至关重要的作用，而TGF-β1R通过结合TGF-β受体复合物来发挥作用，因此，TGF-β1R同样作为肝纤维化程度参考的重要指标〔1，2〕。Smads蛋白已被证实为 TGF-β 家族的特异性细胞内信号转导分子，调控着TGF-β家族的正、负反馈。许多文献报道TGF-β1R也可以依赖 Smad信号通路，来激活 PI3K、ERK、JNK、p38 信号通路〔4，5〕。总之，TGF-β1R 通过结合 TGF-β1 型受体激活MAPK和Smad信号通路促使肝星状细胞活化，从而导致过量细胞外基质的沉积最终导致肝纤维化〔6，7〕。因此说明 TGF-β1R在肝纤维形成过程中起着重要的作用。

西药治疗肝纤维化的药物虽然在临床上取得一定的疗效，但是出现的多种不良反应而使其在临床上应用受到限制。近年来，中医中药抗肝纤维化显现出了明显的疗效优势。实验及临床研究显示中药多种单味中药提取物或中药复方都有确切的抗肝纤维化作用。本研究结果显示，中草药采用益气、化瘀、化痰、养阴四种单剂治疗法都可以降低肝组织内纤维化程度，降低大鼠肝组织TGF-β1R基因和蛋白表达。益气药白术在临床经验配伍中起到较好的抗肝纤维化效果，同时现代药理研究证实，黄芪可以显著抑制实验性肝纤维化大鼠模型的肝纤维化，可以在蛋白水平增强 MMP-2酶蛋白的表达，同时抑制TIMP-2酶蛋白的表达，促进ECM的降解，从而达到逆转肝纤维化的目的〔8〕。姜黄素为姜黄根茎中提取的天然色素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及抗病毒等生物学活性，并且近几年的研究表明姜黄体外可抑制肝星状细胞(HSC)增殖，降低α-SMA的表达并诱导其凋亡等功能，能够明显抑制肝纤维化形成〔9〕。姜黄素抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化物的生成及肝脏TGF-β1R和PDGF的表达〔10〕。川芎之有效成分川芎嗪可能通过降低TGF-β的表达以及改善Smad3与Smad7之间的失衡，从而具有明显的逆转肝纤维化作用〔11〕。川芎能明显抑制CCL4诱导的大鼠肝组织肝纤维化组织中TGF-β1R表达，对肝组织有明显的保护和治疗作用〔12〕。有研究显示，从海藻中提取物可能提高毛细血管内脂蛋白脂酶活性并促进该酶释放，有效降低和降低肝脏总胆固醇TG、TC含量〔13〕。对于中药鳖甲治疗肝纤维化的研究更为广泛，鳖甲提取物通过降低Ⅳ型胶原和Ⅲ型胶原的含量而发挥抗肝纤维化的作用〔14〕。从前述的诸多研究中，可以看出，四种单独治疗方法都有效缓解肝纤维化的功能。但是在我们的研究中发现，在单独应用中，益气法效果略差，化瘀与化痰两者疗效没有明显差异，其中养阴法又能体现更好的疗效，说明鳖甲、白芍具有更好的抗肝纤维化的作用。

肝纤维化根据中医学领域根据临床症候特点，可归属于中医“胁痛”、“积聚”、“痰凝”、“黄疸”等病范畴。在我们的研究同时发现，益气、化瘀、化痰、养阴四种治疗方法综合应用比单剂更能够有效降低肝组织内纤维化程度，降低TGF-β1R的基因和蛋白表达，说明单独治疗虽然有效，减缓肝纤维化的严重程序，但是仍然不能发挥应有的效果。如果综合应用四法，可以互相弥补各自的不足和欠缺，真正符合中医理论“互根互用”的疗效配伍理论体系。本实验以CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型为研究对象，观察经益气、化瘀、化痰、养阴四种单剂和综合应用疗后有效降低大鼠肝纤维组织学变化，有效达到干预TGF-β1R表达的影响。而综合几种方法的疗效特点，说明益气、化瘀、化痰、养阴法可通过抑制TGF-β1R产生和表达，来抑制细胞外基质形成和促进ECM降解，改善肝组织器官代谢状况等途径，从而抑制与延缓肝纤维化的进程，控制肝纤维化这类难治性疾病的进展之目的。

总之，采用肝纤维因子的重要指标作参考依据，评价益气、化瘀、化痰、养阴法等治疗肝纤维化的治疗效果，对于深入阐释中医药益气化瘀化痰法治疗肝纤维化的机制，不断提高中医药防治肝纤维化的水平，促进学科进步具有重要意义。

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